近日，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所在蓝舌病病毒基因组进化与宿主免疫互作机制方面取得新进展，揭示了高CpG的虫媒病毒规避哺乳动物宿主免疫压力的新机制，相关研究成果发表在《细胞报告（Cell Reports）》上。脊椎动物基因组中普遍存在CpG二核苷酸频率受抑制的现象。为适应宿主环境，多数哺乳动物专嗜病毒会模拟宿主的低CpG特征，而昆虫专嗜病毒则无此限制。然而，蓝舌病病毒（BTV）和流行性出血病病毒（EHDV）等多节段双链RNA虫媒病毒，却在基因组中保持较高的CpG含量。它们如何逃避哺乳动物的免疫抑制并实现有效感染，目前尚不明确。研究首次系统证实，哺乳动物宿主蛋白ZAP广泛抑制BTV和EHDV的复制，而对非虫媒传播的轮状病毒（RV）则无显著限制作用。该研究以BTV为模型，揭示了ZAP的双重限制机制：一方面，ZAP通过与真核翻译延伸因子1A结合，进而阻断病毒蛋白的翻译过程；另一方面，ZAP优先识别病毒基因组负链RNA，并介导其降解。值得注意的是，BTV基因组第五节段呈现低CpG特征，其编码的NS1蛋白通过竞争性结合病毒RNA，保护基因组免受识别与降解。提高该节段CpG频率后，突变病毒在体内外的复制能力均显著下降。该研究为基于CpG重编码策略开发新型减毒活疫苗提供了重要理论依据。哈兽研牛羊传染病创新团队与荷兰瓦赫宁根大学联合培养博士研究生邵冉和硕士研究生郗灿坤为论文的第一作者，哈兽研尹鑫研究员和荷兰瓦赫宁根大学Jelke J.Fros教授为通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金和国家重点研发计划等项目资助。原文链接：DOI:10.1016/j.celrep.2025.116742

　　这是12月3日在西藏动物疫控中心（区畜牧总站）曲水实验站牛场拍摄的克隆樟木牛母犊。　　位于拉萨河畔的西藏动物疫控中心（区畜牧总站）曲水实验站牛场里，一头额头带花的黑色小牛时而吃草，时而驻足。这是由科研团队在西藏克隆的樟木牛母犊。　　樟木牛是西藏特有的珍稀畜禽遗传资源。2021年第三次全国畜禽遗传资源普查期间，该牛种在日喀则市聂拉木县樟木镇被系统确认时仅存19头，濒危程度极高，原产地保护面临严峻挑战。　　为探索濒危牛种在本地复原的可能性，科研团队于今年开展了我国首次在高海拔地区进行的克隆牛制备尝试。5月17日，克隆樟木牛母犊在西藏自治区动物疫病预防控制中心（区畜牧总站）曲水实验站顺利诞生。　　据介绍，小牛犊出生后即被纳入24小时动态监测，生长数据全程记录。小牛犊现阶段各项生理指标稳定，食欲旺盛、活动力强，生长发育良好。待其性成熟后，科研人员将开展繁育试验，逐步构建“原地保种+异地保种”相结合的抢救性保护体系，为樟木牛种群恢复提供种质支撑。　　目前，在克隆技术突破与多项保护措施协同推进下，樟木牛种群数量已由最初的19头增至37头。　　新华社记者　丁增尼达　文/图

有很多用户反馈：肉鸡在21日龄免疫新威灵（新城疫活疫苗VG/GA株）之后，原有的呼吸道症状会减轻甚至消失，而且在之后的十几天的时间内，鸡群更不容易生病。对于这种现象的一种解释是：原本的呼吸道症状和新城疫有关，这次免疫起到了紧急接种的作用。但实际上对鸡呼吸道进行病原学检测的结果显示：大多数时候并未检出新城疫病毒，而是检出了传染性支气管炎病病毒，低致病性禽流感病毒，支原体，或者一些细菌。那么为什么免疫了新城疫活疫苗后，鸡的呼吸道症状会减轻呢？以下一项研究似乎可以从一定程度上解释这种现象。本研究所采用动物为商品肉鸡，分别在1日龄免疫了新城疫活疫苗LaSota株或VG/GA株，在免疫后1天，3天和7天，分别检测脾脏和盲肠扁桃体中编码几种非特异性免疫相关蛋白的基因的复制量。这几种蛋白的名称和功能简介如下：Mx1：与GTP结合，并在其结合的状态下与病毒核酸相互作用，从而抑制病毒的复制和传播；IRF7：促进IFN（干扰素）的产生，促进炎性反应；ChIFN-α：鸡α干扰素，诱导抗病毒蛋白的表达，抑制病毒复制，调节免疫应答，诱导免疫细胞到感染部位，增强抗病毒防御机制；MDA5：识别病毒的RNA，诱导Ⅰ型干扰素（IFN）的产生；暴露出病毒CARD结构，进一步触发抗病毒免疫反应；PKR：能够被双链RNA激活，抑制病毒蛋白质合成，并通过调控自噬和激活NF-κB发挥抗病毒作用。以下是试验结果，数字单位为非免疫对照鸡只编码相应蛋白的基因复制量的倍数，带有*的，表示与非免疫对照鸡只对比差异显著。可以看出，在免疫新城疫活疫苗之后，编码几种非特异性免疫相关蛋白的基因的复制量大多呈现出不同程度的增加。对比LaSota组和VG/GA组：在脾脏多数基因的表达量类似，LaSota组中编码Mx1的基因复制量更高。但是在盲肠扁桃体，VG/GA组几乎全部编码5种蛋白的基因的复制量都显著高于LaSota组，而且在免疫后7天仍然保持在较高的水平。编码这几种蛋白的基因复制量增加即意味着这些蛋白的生产量也会同步增长，这几种蛋白的抗病原微生物作用是非特异性的，他们也会对传支病毒、禽流感病毒、支原体和细菌起到杀灭和抑制作用。从试验结果来看，VG/GA株的表现比LaSota株更好，在现场使用中，由于VG/GA株对呼吸道的刺激远比LaSota株弱，对于已经表现出轻微呼吸道症状的鸡群，免疫VG/GA株也要安全得多。向下滑动查看参考文献Hassanin O, Abdallah F, Ali HA, AlGabr N, Mohamed MHA. Different kinetics of chicken interferon-alpha signalling transduction responses following immunization of broiler chickens with different Newcastle disease virus vaccines and infection with virulent genotype VIId strain. Avian Pathol. 2021 Feb;50(1)

环指蛋白4（RNF4）是一种转录因子，在小鼠的睾丸中表达很高，可与雄激素受体互作。有研究者研究显示，RNF4蛋白作为一种转录协调子，在颗粒细胞、卵细胞及精细胞的发育过程中发挥着重要的调控作用。因此选择RNF4做为影响繁殖性状的候选基因。1 材料与方法1.1 材料猪的耳组织统一放在-20℃保存备用。1.2 方法1.2.1 引物的设计与合成  根据RNF4 基因DNA序列设计引物，退火温度为59.1℃。1.2.2 PCR扩增  PCR扩增后，可见937 bp的清晰目的条带。1.2.3 限制性内切酶酶切（RFLP）  PCR产物经内切酶酶切后，观察其分型结果。2 结果与分析2.1 猪RNF4基因的多态位点检测当多态位点为TC基因型时，可见3个片段（937 bp+545 bp+392 bp）；当多态位点为TT基因型时，可见一个片段（937 bp）（图1）。猪RNF4基因SacII酶切分型结果图1  猪RNF4基因SacII酶切分型结果2.2 猪RNF4基因的基因型和等位基因的频率分布发现RNF4基因经过SacII酶切后，在三个猪群中，C等位基因占优势（表1）。2.3 猪RNF4基因三个基因型与猪所有胎次产仔数性状的关联分析通过在淮猪新品系Ⅱ猪群体中分析发现，CC型个体的所有胎次产仔数显著高于TT型个体1.044头（P＜0.05），C等位基因为优势等位基因。详见表2。3 讨论RNF4基因在颗粒细胞、卵细胞及精细胞的发育过程中发挥着重要的调控作用，并发现，RNF4基因的CC基因型在所检测的3个猪群中占优势，这与其他研究者的结果是一致的。所以，在今后的猪的选育初期，可以参考选择RNF4基因的CC型个体作为一个选留参数，以期提高猪的产仔数。

肉类食品安全中饲料安全很关键，饲料中的霉菌毒素污染威胁饲料产品安全。近期，扬州大学 “莲芯肠安” 本科生科创团队揭示霉菌毒素相关致病机制，筛选出防控生猪霉菌毒素中毒的新策略。霉菌毒素由谷物受真菌侵染产生，仔猪饲养阶段受其影响会出现腹泻、生长停滞甚至死亡，带来经济损失。传统脱霉方法只能部分拦截毒素，还会降低饲料利用率。该团队经数百次实验，揭示霉菌毒素通过引发 “铁死亡” 致病新机制，发现核受体蛋白 RORγ 是关键 “开关” 。指导老师蔡德敏教授称，研究为下一代脱霉技术提供思路。团队锁定异莲心碱，实验证明它能激活 RORγ 阻断 “铁死亡” 进程。目前成果正在转化，核心技术已转让，未来团队计划拓展至多种畜禽养殖领域，助力构建新型饲料安全保障体系。

摘要基因定点敲入技术是基因工程和基因治疗的核心工具，旨在避免传统随机整合方法的不可控性及异质性等问题，但是在实际的应用过程中却长期受编辑过程中的脱靶活性和低效性的限制。近年来，位点特异性重组酶系统（如Bxb1整合酶）和可编程核酸酶系统（如CRISPR-Cas9）的发展显著提升了基因敲入的精确性与效率。特别是Cas9-Bxb1整合酶系统的出现，实现了5~43 kb大片段DNA在基因组安全港位点的靶向整合，为功能蛋白生物合成、疾病模型构建、基因功能研究和临床治疗提供了突破性平台。本文系统综述了位点特异性重组酶在精准医学和合成生物学中的应用研究进展。传统的基因敲入方法主要依赖质粒的随机整合或同源重组实现外源DNA的敲入，相较于同源重组方法，随机整合方法对技术的要求较低且耗时较短，因其易于操作性被广泛使用。然而，随机整合在使用过程中却被发现效果不佳，主要是因为整合位点的不可控导致转基因敲入的异质拷贝数，或敲入位置相关的高表达克隆变异，包括转基因拷贝数的丢失、染色体重排和因表观遗传调控而造成的克隆稳定性降低，进而导致后续需要繁琐的筛选流程来确定稳定和高表达克隆。研究发现，转座酶、逆转录病毒、慢病毒载体在染色体整合方面很有效，被广泛应用于基因组工程以提高敲入效率。然而，这些方法都有各自的局限性。例如，基于慢病毒载体技术尽管有效负载能力（18 kb）非常出色，但却具有遗传毒性和免疫原性。逆转录病毒和慢病毒载体倾向于整合附近的转录单位。更重要的是，上述方法均为随机整合，无法精确控制敲入拷贝数，因而难以避免异质性表达的问题。睡美人（sleepingbeauty）和piggyBac这两个最为常见的DNA转座子系统也因缺乏可编程性及在基因组中的“跳跃”特性，成为开发精准基因编辑转座子系统的重大障碍，虽然经过大量的工程改造及与CRISPR系统结合使转座子系统具有靶向性，但是脱靶活性仍然显著。在基因组编辑领域，如何实现大型DNA构建体的高效精准整合一直是亟待解决的关键科学问题。近年来，随着位点特异性重组酶系统（site-specific recombinase，SSR）及核酸酶系统（site-specific nuclease， SSN）的深入研究及应用，大基因片段整合效率得到显著提升。目前，这两种方法在基因敲入方面都具有很大应用潜力。值得关注的是，最近研究者开发了一种新的工具，将RNA引导的Cas9和位点特异性整合酶Bxb1结合起来，成功实现了5~43 kb大片段DNA的定向整合，这一技术突破不仅为构建稳定转基因细胞系提供了新工具，更在基因治疗和生物制药领域展现出广阔的临床应用前景和商业价值。本文也将就这一新技术的发展略作介绍和讨论。1 技术原理与发展脉络基因编辑领域近年来迎来了革命性的技术突破——Cas9-Bxb1整合酶联合工具箱的诞生。该系统将CRISPR-Cas9系统的可编程靶向能力与Bxb1整合酶的大片段DNA精准整合特性相结合，实现了基因组编辑从“小修小补”到“整体替换”的跨越。Bxb1作为一种来源于耻垢分枝杆菌的丝氨酸重组酶，通过识别特定的附着位点（attP/attB）实现DNA片段的不可逆单向整合，其最大优势在于近乎零脱靶活性（伪attP位点识别率<0.1%）及高达60%的整合效率。然而传统Bxb1系统存在可编程性不足的缺陷，需预先在基因组中设置识别位点，限制了广泛应用。为突破这一限制，两大研究团队分别提出了创新性解决方案：

1.1 twinPE+Bxb1系统（哈佛大学刘如谦团队）：采用两步法策略。首先利用双pegRNA引导的先导编辑器（twinPE）在基因组特定位点（如安全港相关基因座）精准插入attB识别序列；随后通过Bxb1整合酶介导携带attP位点的大片段供体DNA（可达5.6 kb）的定向整合。这一策略在Hunter综合征模型治疗中成功修复了IDS基因与假基因IDS2之间的40 kb致病性倒位，修复效率达9.6%。1.2 PASTE系统（麻省理工学院Gootenberg团队）：创造性地将nCas9切口酶、逆转录酶（RT）与Bxb1整合酶融合为单一蛋白复合物（SpCas9-RT-Bxb1），并设计改造的atgRNA引导系统。该方案能在单步反应中实现36 kb超大DNA片段在人类细胞系、原代T细胞和非分裂肝细胞中的高效整合（效率50%-60%）。其独特优势在于不依赖DNA双链断裂（DSB）修复途径，避免了由此引发的染色体结构异常风险。2 效率突破与机制解析检验尽管早期Cas9-Bxb1系统展现出巨大潜力，其整合效率仍难以满足临床应用需求。2024年，刘如谦团队通过噬菌体辅助连续进化（PACE）技术对Bxb1进行定向改造，获得了革命性突破——evoBxb1与eeBxb1两种高效变体。2.1 进化工程提升整合效率2.1.1 PACE进化平台：利用噬菌体生命周期与Bxb1酶活性的偶联，构建了“酶活性-噬菌体增殖”的正向选择系统。通过在数百代进化中施加选择性压力，筛选获得活性提升的突变体。2.1.2 evoBxb1变体：初期进化获得的突变体，在人类细胞中整合效率较野生型Bxb1提高2.7倍。机制研究表明，其活性提升主要源于DNA结合域（DBD）的S37P和R45Q突变，增强了与att位点的亲和力。2.1.3 eeBxb1变体：在evoBxb1基础上引入组合突变（包括催化结构域的D81G和E142K），形成最终的高效版本。该变体在HEK293T、N2a和HuH7细胞系中的平均整合效率达30%，较野生型提高4.2倍；在原代人成纤维细胞的COL7A1和FANCA基因座中分别实现30%和18%的整合率，较前一代PASSIGE系统提升14倍。2.2 结构机制与AI预测eeBxb1超高活性的结构基础一度是未解之谜。由于Bxb1完整多聚体结构尚未解析，研究团队采用 AlphaFold2人工智能预测模型，揭示了关键突变位于酶-DNA相互作用界面：2.2.1 D81G突变：缓解催化口袋的空间位阻，促进重组反应中DNA链转移2.2.2 E142K突变：增强与DNA磷酸骨架的静电相互作用，稳定过渡态构象这些预测通过分子动力学模拟得到验证，为后续理性设计提供了新思路。3 疾病治疗和过表达细胞株构建领域的应用突破Cas9-Bxb1工具箱的高效性和精准性为多种难治性遗传病提供了全新的治疗思路，尤其在传统方法难以应对的大片段基因替换场景中展现出独特价值。3.1 遗传病治疗新模式3.1.1 Cas9-Bxb1系统通过将完整健康基因靶向整合至基因组安全港（如AAVS1位点）或原位替换，实现“一药治百突变”的突破。Prime Medicine公司基于此技术的慢性肉芽肿病（CGD）疗法已获FDA临床试验批准，成为全球首个进入临床阶段的先导编辑疗法。3.1.2 肝脏遗传病模型：在HuH7肝细胞中，eePASSIGE介导的凝血因子IX（F9）基因整合后，表达量达野生型系统的8.7倍。白蛋白启动子驱动的hFIX分泌成功模拟生理性表达模式，为血友病B提供了符合生理调节的治疗方案。3.2 细胞疗法革新CAR-T细胞制备中，慢病毒随机整合导致的插入突变和表达异质性是长期痛点：3.2.1 原代T细胞精准编辑：PASTE系统在T细胞的TRAC位点实现PD1抗性基因（＞10 kb）的定点整合，效率＞50%。对比传统方法，修饰后的CAR-T细胞展现更持久抗肿瘤活性，且未检测到染色体异常。3.2.2iPSC疗法标准化：STRAIGHT-IN技术结合Bxb1与Cre重组酶，在人类诱导多能干细胞（iPSC）中实现170 kb超大片段的无痕整合。通过多轮重组酶处理，成功构建携带多基因回路的“通用型”iPSC库，为再生医学提供标准化细胞源。3.3 复杂结构变异修复传统基因编辑技术难以处理的染色体倒位/重复疾病迎来新希望：3.3.1 Hunter综合征治疗突破：通过twinPE在X染色体q28区同步安装反向attB/attP位点，Bxb1介导40 kb致病区域倒位修复，成功恢复IDS基因功能。该策略效率达9.6%，远高于传统HDR方法（＜0.1%）。3.3.2 大片段缺失疾病模型：在小鼠受精卵中利用Cas9-Bxb1工具箱成功构建DMD基因外显子50缺失模型，为杜氏肌营养不良研究提供精准动物模型。3.3.3 大片段多基因过表达稳转CHo细胞株的构建突破：辉瑞公司开发了一种基于Bxb1重组酶的高保真双位点整合系统，创建了CHO dBxb1宿主细胞系，能够在更短时间生产稳转细胞系。4 前沿拓展与交叉创新Cas9-Bxb1工具箱的应用已超越传统基因治疗范畴，在合成生物学、微生物组工程和农业育种等领域展现出强大生命力。4.1 合成生物学应用4.1.1 基因回路构建：在CHO细胞中利用Big-IN技术实现143 kb人工基因回路的定点整合，包含诱导型启动子、反馈抑制模块和分泌信号肽。该工程细胞株的单克隆表达变异系数（CV）＜15%，远低于随机整合（CV＞50%），大幅提升重组蛋白生产稳定性。4.1.2 染色体尺度工程：英国SynHG计划结合Cas9-Bxb1与人工智能设计，构建抗病毒染色体。通过在特定位点整合CRISPR阵列和抗性基因簇，实现染色体水平的抗病毒功能。4.1.3 功能蛋白生物合成工程：杭州景杰生物科技利用Bxb1整合酶开发了识别H3 K18la兔单克隆抗体的稳转细胞株。他们首先通过phiC31整合酶构建了带有Bxb1整合位点的CHO-S稳转细胞工程株CHO-JJ-9，然后再通过Bxb1整合酶将抗体基因转入该工程株。这种方法大幅缩短了稳转细胞株构建时间，提高了成功率，且获得的稳转细胞株都是高产量；辉瑞公司利用双位点Bxb1-RMCE构建的过表达细胞株双抗生产（Knob-into-hole）表达量11g/L，纯度98.8%。4.2 微生物组工程4.2.1 微生物基因簇克隆：清华大学朱听团队开发的CATCH技术（Cas9-assisted targeting of chromosome segments）将体外Cas9切割与Bxb1整合结合，实现100 kb微生物基因簇的高效克隆。该方案在8小时内完成靶向切割与Gibson组装，大幅加速天然产物生物合成研究。4.2.2细菌工厂优化：丹麦技术大学开发的pAblo·pCasso工具包将dCas9-Bxb1融合体与碱基编辑器偶联，在革兰氏阴性菌中实现可逆DNA编辑。通过精准调控甲羟戊酸合成途径，工程菌的番茄红素产量提升7倍。4.3 农业育种创新4.3.1 多基因叠加育种：在玉米中利用Bxb1介导的多基因叠加，实现抗虫（Bt基因）、抗除草剂（EPSPS）和耐旱（HVA1）性状的同步整合。对比传统杂交育种，周期缩短3代，且无载体骨架残留。4.3.2作物代谢通路重构：通过PASTE系统在水稻基因组“安全港”OsROC5位点整合25 kb维生素A合成通路，黄金稻品系β-胡萝卜素含量达6.5 μg/g，为解决维生素A缺乏症提供新方案。5 现存挑战与未来方向尽管Cas9-Bxb1工具箱取得显著进展，其临床转化仍面临多重挑战，亟需多学科协同创新突破关键技术瓶颈。5.1 递送技术瓶颈5.1.1 体内递送障碍：大分子编辑器（SpCas9-RT-Bxb1＞200 kDa）难以通过AAV载体（容量＜4.7 kb）递送。刘如谦团队正探索 工程化病毒样颗粒（eVLP）解决方案：5.1.2 非病毒递送策略：IDLV（整合酶缺陷型慢病毒载体）在原代成纤维细胞中实现eePASSIGE组分的高效共递送，整合效率达30%。脂质纳米颗粒（LNP）包封的eeBxb1 mRNA在小鼠肝脏显示特异性表达，为体内应用提供可能。5.2 脱靶风险控制5.2.1 脱靶整合检测：开发新型脱靶分析工具DISCOVER-Seq+，通过监测MRE11蛋白在DNA断裂位点的聚集，实现全基因组范围内脱靶事件的灵敏检测。在eePASSIGE处理的细胞中，脱靶整合率＜0.004%。5.2.2正交整合酶开发：Durrant团队从微生物组筛选发现新型重组酶Pc01与Enc9，其att位点与哺乳动物基因组同源性更低。在小鼠实验中，Pc01的脱靶率仅为Bxb1的1/20，为高安全性基因治疗提供新工具。6 结论Cas9-Bxb1整合酶联合工具箱通过融合CRISPR的可编程性和丝氨酸重组酶的高效性，突破了传统基因编辑在大片段精准整合中的技术瓶颈。从twinPE+Bxb1到eePASSIGE的技术跃迁，标志着该领域从概念验证走向临床转化的关键转折。随着递送技术、脱靶控制及伦理框架的同步完善，该技术有望在遗传病根治、细胞疗法升级、农业创新育种和合成生物学等领域释放更大潜力。原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/RkcJL5flbPddCiXvjPCYEg

近日，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所成功构建一种多功能纳米平台 CeO₂/3TT@NP-RVG，该平台能够穿越血脑屏障并实现神经元靶向递送，在脑炎的精准成像与治疗方面展现出巨大的应用潜力。相关研究成果于近日发表在《生物材料（Biomaterials）》上。脑炎是一种危及生命的神经系统疾病，具有高死亡率和严重的长期神经后遗症。目前，由于缺乏针对潜在病理机制的有效治疗手段，加之血脑屏障（BBB）的阻碍，现有临床干预多局限于症状缓解，难以有效抑制铁死亡及活性氧（ROS）介导的神经毒性。该研究提出了融合分子机制干预与精准成像的诊疗一体化新策略，创新性地构建了CeO₂/3TT@NP-RVG纳米平台。该平台能够实现深组织分辨率下的脑炎实时成像，协同清除ROS、抑制炎症因子（TNF-α、IFN-β），并通过泛素化介导下调POR-ACSL4-LPCAT3通路以抑制铁死亡，从而显著提高脑炎小鼠模型的生存率。牛羊传染病创新团队博士后王骞若为论文的第一作者。哈尔滨兽医研究所尹鑫研究员、吉林大学李媛媛教授、香港中文大学(深圳）唐本忠院士为论文的共同通讯作者。该研究得到国家重点研发计划(2022YFE0140700)、吉林省科技发展计划(20240101266JC)及广东省重点领域研发计划(2024B0101040001)等项目资助。原文标题及链接：“Inflammation-Targeted Nanoplatform: NIR-II Imaging-Guided Encephalitis Suppressing by Dual Antioxidant-Ferroptosis Action”https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S014296122500660X?dgcid=coauthor

摘要小干扰 RNA 通常通过序列特异性降解 mRNA 来阻断基因表达。我们此前开发了一种重组腺病毒，该病毒由 U6 启动子驱动，表达三种靶向口蹄疫病毒（FMDV）的短发夹 RNA（Ad-3siRNA）。这些短发夹 RNA 对 FMDV 表现出快速的抗病毒作用。在此，我们研究了 Ad-3siRNA 与口蹄疫灭活疫苗联合使用的免疫刺激效果。通过将 Ad-3siRNA 与口蹄疫（FMD）灭活疫苗联合使用，我们观察到在接种后 1 周内保护效力增强，且小鼠从接种后 1 周开始中和抗体水平升高。此外，接种疫苗和 Ad-3siRNA 联合制剂的猪，接种后 7 周内体液免疫显著增强。Ad-3siRNA可诱导小鼠产生多种细胞因子，如IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15和IL-18。总之，我们证明了 Ad-3siRNA 是一种通过人腺病毒载体递送的新型免疫刺激 RNA，与 FMD 灭活疫苗联合使用时可增强保护作用和体液免疫。Ad-3siRNA在其他病毒性疾病中的应用及进一步的机制研究尚需进一步探索。1. 前言RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是通过小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNA）或短发夹RNA（short hairpin RNAs，shRNA）引导的序列特异性 mRNA 降解来抑制基因表达。已有报道称RNAi应用存在非特异性 “脱靶效应”。免疫刺激性 siRNA（isiRNA）除了抑制靶标表达外，还能触发先天免疫反应。免疫激活通过视黄酸诱导基因 I（RIG-I）、黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA-5）、蛋白激酶 R（PKR）、toll样受体（TLR）3或TLR7/8发生。最近，有报道称isiRNA具有抗病毒和抗肿瘤潜力。此外，isiRNA作为疫苗佐剂已被研究，可增强体液和细胞免疫。口蹄疫（FMD）是一种急性传染性疾病，可感染牛、猪、羊和山羊等偶蹄动物。导致其发热，口腔、舌头、乳头和蹄部起水泡。口蹄疫病毒（FMDV）是一种单链正链 RNA 病毒，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，有7个血清型和 60 多个亚型。目前使用灭活疫苗预防 FMDV 传播，但是，应用过程中应根据血清型和亚型选择不同的疫苗株。此外，使用现有的FMD疫苗形成抗体以控制FMD的爆发是一个漫长的过程。因此，在疫苗诱导的保护性免疫形成之前，可使用抗病毒药物在爆发期间提供快速保护并减少 FMDV 的传播。最近，我们建议将具有佐剂作用的抗病毒药物与 FMD 灭活疫苗联合使用，以实现早期保护和增强疫苗免疫。建议的抗病毒药物是长效猪干扰素（IFN）-α和I型IFN诱导剂，如槲皮素。我们观察到I型IFN和IFN诱导剂在体内能有效增强免疫力并抑制 FMDV 复制。最近，我们建议将具有佐剂作用的抗病毒药物与 FMD 灭活疫苗联合使用，以实现早期保护和增强疫苗免疫。建议的抗病毒药物为持续时间改善的猪干扰素（IFN）-α 和 I 型 IFN 诱导剂，如槲皮素。我们观察到I型IFN和IFN诱导剂在体内能有效增强免疫力并抑制FMDV复制。我们开发了一种重组腺病毒，可同时表达三种靶向 FMDV非结构蛋白区域的三种短发夹RNA（shRNA），其中Ad-3siRNA能诱导快速（在感染后6小时内）且有效的FMDV抑制。通过利用5型人腺病毒递送载体，它可直接应用于包括小鼠和猪在内的多种宿主。我们建议通过联合使用 siRNA和I型IFN以产生快速起效且持久的保护力从而控制猪群中FMD。然而，我们并不排除Ad-3siRNA作为IFN诱导剂的潜力，因为除了一些isiRNA报道之外，还有关于Ad-3siRNA可刺激猪细胞中的干扰素刺激基因（ISG）的报告。在此，我们研究了Ad-3siRNA与FMD灭活疫苗联合使用的免疫刺激效果，重点关注猪细胞中I型IFN的产生和 ISG 的表达，以及Ad-3siRNA与FMD疫苗联合使用在小鼠和猪中诱导的中和抗体滴度。2. 材料和方法2.1 细胞和病毒人胚胎肾（HEK）293细胞：在含4mM L-谷氨酰胺的293无血清培养基中培养，置于37°C、5%CO₂培养箱中。猪肾（IBRS-2和LFBK）细胞使用添加10%胎牛血清（FBS，pH7.4）的DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱中进行培养。表达5型人腺病毒E1 DNA的HEK293细胞用于扩增重组腺病毒和进行腺病毒滴度测定。IBRS-2 细胞用于测试干扰素和 ISG 诱导。LFBK细胞用于病毒中和试验和FMDV滴度测定。表达多种靶向 FMDV 的 siRNA的重组腺病毒（Ad-3siRNA）和重组腺病毒阴性对照（Ad-null control）由我们实验室建立。三种shRNA靶向FMDV基因组的高度保守的2B和3C区域（图 1A）。腺病毒DNA包含三个U6启动子、shRNA 编码序列（2B、3C2和 3C1 shRNA）以及含六个胸苷的pol III 转录终止子（图 1B）。韩国FMDV分离株O/SKR/Boeun/2017（GenBank登录号MG983730）用于评估抗病毒效果，FMDV A/SKR/Yeoncheon/2017（GenBank登录号KR766148）用于病毒中和抗体检测。使用Karber法测定和计算病毒滴度（Ramakrishnan，2016）。图1. Ad-3siRNA示意图。（A）口蹄疫病毒全基因组示意图。黑色箭头表示shRNA的靶区域。（B）Ad-3siRNA的构建。腺病毒DNA含有三个U6启动子、shRNA编码序列（2B、3C 2和3C 1 shRNA）和pol III转录终止子。2.2 I型干扰素蛋白检测将 IBRS-2细胞（3×10⁵个细胞/孔）接种到 24 孔板中。次日，用50感染复数（MOI）的Ad-3siRNA或Ad-null control感染细胞，在37°C下孵育。感染后2小时用新鲜培养基更换培养基后，将细胞在37°C下孵育。在8、24和48小时收集上清液，使用猪 IFN-α 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒和猪 IFN-β ELISA 试剂盒测量上清液中的猪 IFN-α 和 IFN-β 水平。2.3 干扰素测定如前所述，通过基于 FMDV 的 IFN 测定分析 24 和 48 小时收集上清液的抗病毒活性。简而言之，将 LFBK 细胞在 96 孔板中培养至90%。然后加入两倍稀释的上清液。24小时后，移除上清液，每孔用250 TCID50的FMDV 感染 1小时，并在 37°C下孵育 48 小时。在诱导 50%细胞病变效应（CPE）抑制的最高稀释度下测量抗FMDV的抗病毒活性（单位）。2.4 动物实验7 周龄雌性C57BL/6小鼠，BALB/c小鼠，FMDV中和抗体阴性（中和抗体滴度2.4.1 小鼠保护作用分析C57BL/6小鼠（每组5只）在攻毒前1天或7天通过肌内注射 FMD 疫苗、Ad-3siRNA 或 Ad-null control 的组合（3×10⁸ TCID50/dose）或PBS，以评估对FMDV的保护作用。FMD 灭活疫苗由A/SKR/Yeoncheon/2017的FMD疫苗抗原（0.25 μg /dose）、10%氢氧化铝凝胶和Montanide ISA 206配制而成。通过腹腔注射250LD50的小鼠适应型 FMDV A/Malaysia/97攻击小鼠。在攻击后8天内监测小鼠的存活率。2.4.2 小鼠体液免疫测定（短期）为分析接种后三周的中和抗体水平，使用C57BL/6小鼠（每组5只），通过肌内注射FMD疫苗、Ad-3siRNA或Ad-null control（3×10⁸ TCID50/dose）的组合或PBS。FMD 灭活疫苗使用A/SKR/Yeoncheon/2017 的疫苗抗原（1μg/头份）、10% 氢氧化铝凝胶和 Montanide ISA 206配制而成。在接种后1、2和3周采血分离血清。2.4.3 猪体液免疫测定（长期）为长期分析抗体水平，对猪（每组4只）通过肌内注射FMD疫苗、疫苗和Ad-3siRNA 的组合或Ad-null control（1×10¹⁰TCID50/头份），不进行加强免疫。在 1、3、5和7周采血分离血清。2.4.4 病毒中和试验（VNT）小鼠和猪血清在56℃下热灭活30 min备用，按照《陆生动物诊断测试和疫苗手册》（WOAH，2022）指南进行病毒中和试验。在LFBK细胞中传代四次的 FMDV A/SKR/Yeoncheon/2017用于VNT。2.4.5 小鼠中细胞因子测定如前所述进行小鼠细胞因子测定。每组4只BALB/c小鼠通过腹腔注射 0.1mL的Ad-3siRNA或Ad-null control（3×10⁸ TCID50/dose）。在接种后0、16、24和48小时采血分离血清，血清用于使用小鼠 IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15和 IL-18 ELISA试剂盒测量 IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15 和 IL-18 的浓度。通过标准曲线插值确定蛋白质浓度。2.5 猪细胞的逆转录-定量PCR（RT-qPCR）分析将 IBRS-2 细胞（1×106个细胞/孔）接种到6孔板中，用50MOI的Ad-3siRNA 或 Ad-null control感染，并在 37°C 下孵育。在24和48小时收集细胞。如前所述进行 RNA 提取、DNase I处理和RT-qPCR。RT-qPCR检测2'-5' OAS、PKR 和 Mx mRNA的ISG 表达分析以及RLR信号相关基因RIG-I、MDA-5和核因子 κB 激酶ε抑制剂（IKKε）的表达。猪甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）用作内参。2.6 统计分析使用GraphPad Prism进行非配对t检验。3. 结果3.1 Ad-3siRNA对猪细胞I型干扰素的诱导作用测量用 Ad-3siRNA 或 Ad-null control 处理的猪细胞上清液中的IFN蛋白水平和抗病毒活性。与Ad-null control感染的细胞上清液相比，在Ad-3siRNA感染的细胞上清液中，24小时感染后检测到更高水平的猪IFN-α蛋白（图2A，P图2.检测用Ad-3siRNA感染的猪细胞的上清液中的I型IFN（A）猪IFN-α蛋白水平、（B）IFN-β蛋白的水平、(C)使用Ad 3siRNA感染的猪细胞的上清液测量抗FMDV活性3.2.Ad-3siRNA 与 FMD 疫苗联合在小鼠中引发早期保护和增强的中和抗体水平为测试Ad-3siRNA与FMD疫苗在接种后1周内的保护效果，监测接种疫苗和Ad-3siRNA的小鼠的存活率（图3A和B）。与PBS组小鼠相比，注射疫苗、疫苗+Ad-null control或疫苗+Ad-3siRNA的小鼠存活率更高。然而，接种后1或7天，疫苗+Ad-3siRNA组的存活率（100%）均显著高于疫苗组或疫苗+Ad-null control 组。为评估Ad-3siRNA在接种早期对体液免疫的影响，测量了免疫后3周的中和抗体滴度（VN 滴度）（图 3C）。疫苗+ Ad-3siRNA组在接种后1、2和3周的VN滴度均高于疫苗组或疫苗+ Ad-null control组（P图3. 小鼠生存曲线和中和抗体水平（A）在FMDV感染前1天小鼠生存曲线，（B）在FMDV感染前7天小鼠生存曲线(C)血清中和抗体试验结果。虚线表示1：32（log 10 1.5）病毒中和滴度临界水平。3.3 Ad-3siRNA与口蹄疫疫苗联合应用增强猪体液免疫情况为评估Ad-3siRNA 对自然宿主体液免疫的持续影响，给猪单次注射疫苗或疫苗与Ad-3siRNA（或 Ad-null control）的组合，监测免疫后7周中和抗体滴度（图 4）。疫苗+Ad-3siRNA 组在免疫后第3、5和7周的VN滴度高于疫苗组或疫苗+ Ad-null control组（P图4.猪中病毒中和抗体水平3.4 ISG和RLR的上调测量用Ad-3siRNA或Ad-null control 处理的猪细胞中ISG（如寡腺苷酸合成酶（OAS）、粘液病毒抗性（Mx）和 PKR）的mRNA水平。与Ad-null control感染或未处理的细胞相比，Ad-3siRNA感染的细胞中观察到显著升高（P图5. Ad-3 siRNA上调猪细胞干扰素刺激基因和RIG-I样受体信号相关基因表达3.5 Ad-3siRNA 在小鼠中诱导细胞因子为分析Ad-3siRNA在体内诱导的细胞因子，测量腹腔注射Ad-3siRNA的小鼠血清样本中的细胞因子水平。与接种Ad-null control的小鼠相比，注射Ad 3siRNA的小鼠在16-48小时内的IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15和IL-18水平显著升高（图6，P 图6. Ad-3siRNA 在小鼠中诱导细胞因子4. 讨论SiRNA可用于安全快速的抗病毒治疗策略中。然而，外源性siRNA的作用持续时间短，并且靶病毒可进化出抗性机制以避开 siRNA。在某些情况下，siRNA诱导先天免疫，从而影响其疗效。然而，免疫激活可能有利于控制病毒感染，isiRNA可能促进长期和广谱的抗病毒作用。在本研究中，我们提出表达多种抗 FMDV siRNA的重组腺病毒（Ad-3siRNA）作为一种新型免疫调节剂，它可诱导包括I型IFN在内的多种细胞因子，并与 FMD 疫苗联合使用时具有佐剂作用。Ad-3siRNA旨在抑制多种血清型的 FMDV。Ad-3siRNA 是一种直接作用的 FMDV抑制剂，这也是其作用迅速的原因。靶区域是2B和3C基因，已知它们是FMDV基因组中最保守的区域。我们先前观察到仅注射Ad-3siRNA的乳鼠对FMDV有保护作用（7天存活率约90%）。这种抑制可能是由于多种siRNA的基因沉默，而非免疫调节导致，因为乳鼠没有包括先天免疫在内的成熟的免疫系统。此外，由于半衰期短，进行了三次Ad-3siRNA注射。有鉴于此，我们采用Ad-3siRNA与I型IFN（猪IFN-α）联合使用，以克服siRNA的缺点，如作用时间短和因病毒突变而降低效力。I型IFN（或IFN诱导剂）通过增强抗病毒作用和体液免疫，可能是一种有前景的快速有效保护策略。在本研究中，我们清楚地表明Ad-3siRNA在体外和体内诱导I型IFN，因此可有效用作FMD疫苗佐剂。Ad-3siRNA与FMD疫苗联合使用时，除了增强体内中和抗体的产生外，还刺激了多种细胞因子的产生，如I型IFN、IFN-γ、IL-12、IL-15、IL-6和IL-18。据报道，IFN-α为FMD疫苗的有效佐剂。此外，IFN-γ、IL-12 和 IL-15 参与 T 细胞免疫并对病毒复制产生抑制作用。IL-18刺激B细胞增殖、IFN-γ产生和辅助性T细胞2（Th2）反应。IL-6也是B细胞活化的关键细胞因子。尽管Ad-3siRNA诱导细胞因子，但我们在实验小鼠和猪中未观察到副作用。在我们的小鼠实验中未观察到体重减轻、异常运动或死亡。在猪实验中，我们同时使用Ad-3siRNA和FMD疫苗，也未观察到死亡、异常运动或皮疹。注射I型IFN或IFN诱导剂的动物通常会出现暂时性体温升高。然而，这种症状通常在1到2天内消失，并且在Ad-3siRNA组中不明显。Ad-3siRNA 的佐剂有效性和安全性是剂量依赖性的，应在猪中进行实际应用测试。除佐剂作用外，Ad-3siRNA诱导I型IFN在控制病毒方面可能具有优势。（1）我们认为Ad-3siRNA 的抗病毒作用可能通过其免疫调节作用介导。I型IFN是对抗FMDV产生的最有效的抗病毒蛋白之一。此外，我们观察到小鼠对FMDV的保护作用（100% 存活率）在注射后7天得以维持。I型IFN广泛抑制病毒复制并刺激免疫细胞，包括树突状细胞、B细胞和T细胞。（2）尽管Ad-3siRNA最初被开发为一种仅靶向FMDV的siRNA，但我们观察到它具有广泛的抗病毒效果，不仅限于FMDV，还针对BEV和PRRSV。众所周知，I型IFN对多种病毒具有抗病毒作用。在不同种属（如猪、牛和猴）的细胞中观察到这些效应。除了诱导小鼠IFN-α和IFN-β外，还在猪细胞中也诱导猪IFN-α和IFN-β。此外，本研究中使用的人腺病毒载体具有广泛的宿主范围，包括猪和牛。已有几项使用5型人腺病毒载体控制FMDV的研究报道。因此，我们认为Ad-3siRNA可用于不同动物体内抗多种病毒的研究。人腺病毒5型在 HEK293细胞中产生。可产生高滴度的重组腺病毒（10¹¹⁻¹² pfu/mL），并且在 HEK293细胞中可进行悬浮培养。我们认为，由于Ad-3siRNA 在293细胞中不产生蛋白质，因此在家畜中的应用不需要特殊的纯化过程。我们使用CRISPR Cas-9技术开发了IFNAR KO 293悬浮细胞系，并且在这些细胞系中获得更高滴度的重组腺病毒。因此，我们认为，对于5型腺病毒载体的应用，成本不会是一个重大问题。实际生产成本取决于公司的生产效率。此外，应考虑家畜的效果和成本来确定最佳剂量。Ad-3siRNA的免疫刺激作用机制尚不清楚。一种可能性是Ad-3siRNA可通过 RIG-I和（或）MDA-5信号传导诱导先天免疫。RLRs是检测病原体相关分子模式并启动包括I型IFN表达在内的抗病毒反应的细胞质 dsRNA传感器。RLRs包括MDA-5、RIG-I和遗传学与生理学实验室 2（LGP2）。其中，MDA-5和RIG-I与病毒RNA的结合触发信号级联以诱导I型IFN表达。我们观察到，尽管在RIG-I敲除细胞和对照细胞中OAS的mRNA水平上调，但在MDA-5敲除细胞中未增强（图S1）。还表明Ad-3siRNA可能是RIG-I和MDA-5的双重激动剂，可上调RIG-I、MDA-5和IKKε的表达。在基因设计方面，我们认为使用多个shRNA和U6（Pol III）启动子表达shRNA可能是Ad-3siRNA诱导I型IFN的关键因素。先前的研究也报道，与 Pol II 启动子相比，具有 U6（RNA 聚合酶III）启动子表达 shRNA 的病毒载体更可能诱导 IFN。此外，观察到与三种shRNA不同，用表达由U6启动子驱动的单个shRNA的腺病毒处理的细胞中，ISG mRNA没有上调。因此，有必要详细研究Ad-3siRNA引发的IFN信号传导机制。总之，我们的研究表明，通过人腺病毒载体递送的新型免疫刺激RNA Ad-3siRNA是一种有前景的佐剂，它可诱导多种细胞因子并通过刺激中和抗体产生来增强FMD疫苗的效果。因此，Ad-3siRNA与疫苗联合使用可能更有效地预防FMD的传播。未来，应探索Ad-3siRNA在不同动物的多种病毒性疾病中的应用，并进行详细的机制研究。

近日，中国农业科学院上海兽医研究所家禽病毒病监测预警和防控团队揭示影响新城疫病毒复制和毒力的机制，相关研究成果发表在《Veterinary Research》上。研究背景基质蛋白是新城疫病毒的重要结构蛋白，具有在细胞核和细胞质中穿梭的特性。然而，对于基质蛋白核质穿梭的机制，尤其是其出核“行为”对病毒的作用仍不清楚研究进展该研究通过对比不同基因型新城疫病毒的基质蛋白核输出序列，发现该序列随病毒进化存在显著差异，影响基质蛋白出核和出芽效率，进而影响病毒复制和毒力。进一步研究首次证实该序列通过经典核输出途径介导基质蛋白出核，更新了对新城疫病毒基质蛋白出核机制的认识，为副黏病毒防控提供了新理论依据。NDV M蛋白的NES257-266基序促进M蛋白出核和病毒出芽项目资助中国农业科学院上海兽医研究所博士研究生张耀东为论文第一作者，仇旭升研究员为论文通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、十四五国家重点研发计划等项目的支持。来源：中国农科院上海兽医研究所

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）被世界动物卫生组织（WOAH）列为法定报告的动物疫病，是危害世界养猪业的“头号杀手”。自2018年以来，ASF疫情给我国养猪产业造成直接经济损失超过10 000亿元，严重影响肉食品供应、国际贸易以及社会经济稳定。目前，由于没有安全、有效的商品化疫苗用于ASF的防控，我国ASF疫情依然严峻复杂，其持续存在是制约我国养猪业健康发展的瓶颈。非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）基因组庞大，目前不仅许多基因未注释，已注释的基因中也有约50%的基因功能未知。由于人们对ASFV的感染与致病机制的认知有限，制约了安全、高效的 ASFV疫苗的研发。制备ASFV蛋白抗体，将为研究ASFV蛋白功能提供生物材料，对于阐明ASFV的感染与致病机制具有重要意义。近期，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所基础免疫创新团队完成的题为“非洲猪瘟病毒pD345L蛋白单克隆抗体的制备及其表位鉴定”的研究在《中国农业科学》2025年第58卷16期正式发表。该研究构建pET-28a-D345L重组原核表达质粒，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，表达并用亲和层析方法纯化重组的pD345L蛋白（rpD345L）。将纯化的rpD345L与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫5周龄SPF级BALB/c小鼠，每隔两周免疫一次，共免疫3次。第二次和第三次免疫均用弗氏不完全佐剂乳化。第三次免疫一周后通过小鼠颌下静脉采血，分离血清，利用ELISA方法检测血清抗体效价，选取抗体效价高的小鼠加强免疫。免疫3 d后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合。将重组GST-pD345L作为包被抗原，利用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，经过3次筛选得到能够稳定分泌pD345L mAbs的杂交瘤细胞株，注入小鼠腹腔制备腹水。使用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定mAbs的重、轻链类型。利用外源过表达的pD345L和ASFV HLJ/18株感染的猪肺泡巨噬细胞（PAMs）为抗原，用制备的mAbs作为一抗，分别进行Western blot和间接免疫荧光（IFA）鉴定。随后将截短的pD345L与GST融合表达，用筛选的mAbs鉴定抗原表位，分析鉴定的抗原表位在不同ASFV毒株中的保守性。结果表明，IPTG诱导后，pD345L以包涵体形式表达，分子量为40.5 kDa。将其免疫BALB/c小鼠后经间接ELISA方法筛选得到2株稳定分泌pD345L mAbs的杂交瘤细胞株，命名为10H3和5G1。His-rpD345L的SDS-PAGE及Western blot鉴定亚类鉴定结果显示，2株mAbs重链类型均为IgG1型，轻链类型为κ链，抗体效价为1:1 638 400。pD345L mAbs的亚类鉴定及腹水效价检测Western blot和IFA结果显示，制备的mAbs均能识别天然表达的pD345L。经Western blot确定抗原表位，结果显示10H3和5G1 mAbs的最小线性B细胞表位分别为1METFVRLFKD10和321YEKICCSEES330，这两个抗原表位在ASFV不同毒株中具有保守性。抗pD345L mAbs识别pD345L的Western blot检测pD345L mAbs识别pD345L的IFA检测Western blot鉴定pD345L mAbs识别的抗原表位综上，本研究原核表达并纯化了rpD345L，制备了2株pD345L mAbs，并鉴定了其识别的抗原表位，且这2株mAbs均能有效识别ASFV感染过程中表达的pD345L，为进一步研究ASFV pD345L功能奠定基础。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黄丽研究员为该文通讯作者，贺筱萍为第一作者。该研究获得国家自然科学基金（32322081，32270156）、中国农业科学院科学中心项目（CAAS-CSLPDCP-202401，CAAS-CSLPDCP-2023002）的资助。全文链接：《非洲猪瘟病毒pD345L蛋白单克隆抗体的制备及其表位鉴定》贺筱萍, 张元峰, 刘学敏, 黄丽, 翁长江. 非洲猪瘟病毒pD345L蛋白单克隆抗体的制备及其表位鉴定[J]. 中国农业科学, 2025, 58(16): 3345-3356.HE XiaoPing, ZHANG YuanFeng, LIU XueMin, HUANG Li, WENG ChangJiang. Preparation of Monoclonal Antibody Against African Swine Fever Virus pD345L Protein and Identification of Its Epitope[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2025, 58(16): 3345-3356.

棘球绦虫生活史及囊型/泡型包虫病全球分布一、项目技术背景包虫病是一种严重的人兽共患寄生虫病，不仅对人类健康构成重大威胁，还制约着畜牧业发展，破坏生态环境卫生。该病主要分为囊型包虫病和泡型包虫病，分别由细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫感染引起，其中囊型包虫病占主导地位。包虫病的分布具有全球性，在各大洲均有流行。在共建“一带一路”沿线国家，受包虫病威胁的人口已达5亿。在我国，包虫病主要流行于西北畜牧地区，包括新疆、西藏、青海、内蒙古等省（自治区）。据世界卫生组织报告，全球每年因包虫病产生的治疗费用及畜牧业损失总计约30亿美元。我国作为畜牧业大国，包虫病每年给畜牧业造成的经济损失高达数亿元人民币。国家对包虫病防控工作高度重视，相继出台了一系列针对性政策。2024年，多部门联合印发的《全国包虫病等重点寄生虫病综合防治实施方案（2024—2030年）》，明确强调要进一步强化包虫病药物治疗，并提出“到2030年，全国所有包虫病流行县达到疫情控制标准”的战略目标。同时，农业农村部持续完善政策体系，先后出台《兽药注册评审工作程序》《关于促进兽药产业健康发展的指导意见》等文件，为包虫病防治相关兽药的研发提供了坚实的政策保障。目前，用于治疗包虫病的兽药主要有阿苯达唑和吡喹酮，但二者均无法对绵羊、牛等动物的包虫病产生理想疗效。作为世界卫生组织推荐的广谱驱虫药，阿苯达唑虽被广泛用于包虫病治疗，但仅能抑制虫体生长，无法彻底杀灭虫体。其治疗需长期（通常一个月以上）大剂量用药，且治愈率偏低，仅约30%。更值得注意的是，长期使用阿苯达唑会引发肝肾毒性，导致绵羊出现恶心、呕吐等不良反应；其潜在的生殖毒性，还可能对妊娠母羊造成难以预估的伤害。这些问题使得阿苯达唑治疗需投入大量人力、物力，却收效甚微。另一常用药吡喹酮同样为广谱驱虫药，但其对牛、羊等动物包虫病的疗效不及阿苯达唑，仅适用于犬等终宿主的驱虫。自阿苯达唑上市至今，近50年来全球尚无新的抗包虫病兽药问世。因此，研发安全高效的新型抗包虫病兽药已成为亟待解决的问题。二、项目创新点1.抗包虫病新药研发历程早在20世纪90年代，新疆医科大学第二附属医院就研制出用于治疗包虫病的院内制剂——骆驼蓬总碱片，且在临床应用中取得了一定疗效。随后，研究人员对该制剂中的活性成分展开分析，发现去氢骆驼蓬碱是发挥主要抗包虫病作用的物质。不过，由于去氢骆驼蓬碱存在明显的神经毒副作用，其未能进一步推向临床应用。基于此，新疆医科大学与中国药科大学组成科研项目团队针对去氢骆驼蓬碱的β-咔啉母核进行结构修饰，设计并合成了一系列去氢骆驼蓬碱衍生物。其中，化合物1a展现出显著的抗包虫病疗效：在体外实验中，它能有效杀灭细粒棘球绦虫原头节；在体内实验中，可有效抑制囊肿生长。但遗憾的是，化合物1a的口服生物利用度几乎为零，这极大地限制了其临床应用前景。为解决这一问题，项目团队进一步探究了1a在体内的代谢产物，明确主要代谢位点后，再次对1a进行结构修饰，设计并合成了一系列1a类似物。研究发现，化合物1a-1在保留抗包虫病活性的同时，药代动力学性质得到显著改善，具备良好的成药性，有望成为潜在的抗包虫病候选新药。2.高效的抗包虫病作用化合物1a-1在体外能有效抑制细粒棘球绦虫原头节生长，破坏虫体结构，LC50为7.5μm，体外活性与阿苯达唑（LC50=153.6μm）相比提高约20倍。在继发感染微囊泡包虫病小鼠模型中，1a-1在50mg/kg剂量下，连续治疗28天，能有效抑制囊肿生长，抑囊率达77.67%，明显优于同剂量下阿苯达唑（49.18%）。在自然感染细粒棘球绦虫绵羊模型中，1a-1通过口服给药（25mg/kg）和静脉注射（2.5mg/kg），连续治疗14天后，能有效抑制绵羊肝脏囊肿生长，并且起效快，一周内囊肿就开始缩小。1a-1口服给药组绵羊肝脏囊肿缩小86%，静脉注射组绵羊肝脏囊肿缩小92%，明显优于阿苯达唑（59%）。3.良好的药代动力学性质及安全性在SD大鼠中，1a-1在25mg/kg剂量下单次口服给药后，口服生物利用度可达27.9%，半衰期为3.30小时。在健康绵羊中，1a-1在25mg/kg剂量下单次口服给药后，口服生物利用度为36.90%。1a-1在25mg/kg剂量下连续三次（每天一次）口服给药后，半衰期达46.5小时。在1a-1治疗包虫病绵羊期间，绵羊精神状态良好，摄食、饮水、呼吸及活动正常，体重稳步上升。相比之下，阿苯达唑治疗期间，绵羊出现不进食、腹泻等副反应，体重明显降低。4.全新的作用靶标及机制靶标垂钓研究发现，棘球绦虫5-HT受体（Eg5-HT7R）是1a-1的作用靶点。通过表面等离子共振技术检测1a-1与Eg5-HT7R结合KD值为3.3nM。1a-1通过靶向Eg5-HT7R，干扰棘球绦虫葡萄糖代谢，进而杀虫。5.更低的生产成本1a-1的实验室小试生产成本为4000~5000元/kg，低于阿苯达唑（约7000元/kg），未来工业化生产将进一步降低成本，预期成本约3000元/kg。6.更经济的治疗成本1a-1口服或静脉给药，疗程2周，治疗成本不超过90元。相比之下，阿苯达唑口服给药，疗程至少一个月，治疗成本不低于200元。三、项目团队介绍项目带头人为黄张建教授，教育部长江学者特聘教授，中组部第十批、第十一批援疆干部。团队成员包括深耕包虫病防诊治临床研究的温浩教授，负责新药设计与合成的吴建兵副研究员以及从事药理毒理学研究的陈蓓主任药师。该项目已发表科研论文三篇，申请两项核心专利（ZL202310838632.4、CN202510332101.7），PCT专利正在申请中，旨在布局海外市场。四、未来商业价值当前，包虫病治疗市场规模正呈上升态势，2024年已达到14.2亿美元，预计至2032年将增长至19.5亿美元。结合我国畜牧业的产业规模及绵羊等牲畜的存栏量估算，国内包虫病兽药市场规模可达数亿元人民币。随着全球畜牧业发达国家对包虫病防治需求的不断攀升，兽药需求量将进一步扩大，预计全球市场规模将达到数十亿美元。在这样的市场背景下，1a-1作为新型抗包虫病兽药，在疗效、安全性及经济性上均优于现有药物阿苯达唑，具备显著竞争优势。未来，若1a-1进入我国包虫病兽药市场，有望成为一款重磅药物，年创收可达数亿元；同时，凭借其优异性能拓展至其他包虫病高发国家，商业价值将得到进一步提升。项目联系人 黄张建教授 新疆医科大学/中国药科大学电话：18052017178邮箱：cpudahuang@163.com吴建兵 副研究员 中国药科大学电话：15251753235邮箱：jwu@cpu.edu.cn

肠道是哺乳动物最关键的消化器官，也是最大的免疫器官，在营养吸收、内分泌调控以及抵御病原入侵等方面发挥着核心作用。家猪是由野猪驯化而来，经过长期人工选择，在体型、生长性能和环境适应性等方面与野猪形成了显著差异，这些差异同样可能体现在肠道的免疫功能和营养吸收机制上。与此同时，猪在出生后会经历断奶前、断奶后、生长高峰和成年等关键发育阶段，其肠道细胞组成和功能也呈现持续的动态变化。然而，目前关于家猪与野猪在不同发育阶段肠道特征的系统性研究仍然不足，尤其缺乏单细胞分辨率下的深入认知。近日，SCIENCE CHINA Life Sciences在线发表江西农业大学猪遗传改良与种质创新全国重点实验室黄路生院士团队的研究性论文，题为“Single-nucleus transcriptome profiling of wild boar and domestic pig intestines reveals the spatiotemporal dynamics of immunity and nutrient absorption”。该研究综合应用snRNA-seq、Stereo-seq、免疫荧光和代谢组学等手段，系统揭示了家猪与野猪肠道在免疫与营养吸收方面的时空动态及其特征，为深入理解猪肠道功能多样性提供了新的细胞和分子层面见解。1绘制了迄今为止最全面系统的猪肠道snRNA-seq图谱，鉴定并验证了稀有细胞类型该研究针对断奶前（30天）、断奶后（42天）、生长高峰（150天）和成年阶段（730天）共四个关键生长发育阶段的家猪与野猪回肠及盲肠开展了snRNA-seq分析，鉴定出19种主要细胞类型和58种细胞亚型，包括先前未表征的稀有细胞亚型：EBF1+成纤维细胞，TMEM163+巨噬细胞及表达FCAMR的神经元细胞亚型，并通过免疫荧光实验加以验证。图1 野猪和家猪肠道细胞的多样性2发现回肠和盲肠细胞呈现高度异质性，揭示了回肠神经元细胞调控炎症反应的机制通过对回肠和盲肠的比较分析，研究发现两者的细胞组成和基因表达存在显著差异，其中回肠细胞表现出更高的免疫相关基因表达。回肠神经元细胞则高表达与炎症反应调节相关的基因。进一步的细胞间互作分析显示，回肠神经元细胞可通过NAMPT-INSR配体受体对与树突状细胞和淋巴内皮细胞进行通讯，从而调控炎症反应，空间转录组数据进一步支持了这些细胞间的互作。图2 回肠神经元通过NAMPT-INSR与树突状细胞和淋巴内皮细胞互作来调控炎症反应3揭示了家猪与野猪肠道免疫及营养吸收的差异及其分子机制比较分析表明，相比家猪，野猪肠道具有更强的免疫功能，尤其是由浆细胞介导的体液免疫。作者进一步结合肠道代谢组数据，揭示了短链脂肪酸（丙酸和乙酸）能够诱导B细胞中XBP1和SDC1的表达，促进其向浆细胞分化，从而增加浆细胞比例并增强体液免疫相关基因的表达，为野猪更强的免疫功能提供了分子基础。此外，研究还发现野猪肠道表现出更强的营养吸收能力。通过基因调控网络分析，作者进一步鉴定出参与肠道营养吸收调控的NR1H4和FOXO1基因调控网络。图3 家猪与野猪肠道免疫和营养吸收的细胞与分子差异及野猪肠道细胞的发育特征4系统揭示了出生后野猪肠道的发育动态与特征通过发育时间分析，作者鉴定了随发育持续变化的基因及其功能通路，其中包括多种炎症性肠病风险基因和囊性纤维化相关基因。结果显示，随着出生后发育进程推进，肠道的消化吸收功能和T细胞介导的免疫逐渐增强。此外，作者还发现了细胞类型特异性的发育模式，不同细胞类型在发育过程中呈现出差异化特征，其中浆细胞表现出最显著的发育变化。5揭示了人和猪肠道中高度保守的细胞类型和基因通过对人和猪肠道的比较分析，作者发现两者在细胞类型及其特异性基因上具有高度保守性，这些基因包括关键转录因子以及多种炎症性肠病风险基因。这项研究绘制了不同发育阶段家猪和野猪肠道的单核转录组图谱，系统揭示了其在细胞组成、分子特征及发育动态上的差异与规律。该成果不仅为解析家猪和野猪在免疫功能与营养吸收机制上的分子基础提供了新的视角，也为提升猪的饲料转化效率和健康养殖水平提供了理论依据。同时，这一资源还为深入理解人类肠道疾病的发生机制及潜在治疗策略提供了重要参考。中国科学院院士、中国畜牧兽医学会理事长黄路生教授为论文通讯作者，江西农业大学博士后肖燕园为第一作者兼共同通讯作者，江西农业大学博士邹霄霄为共同第一作者。研究团队成员杨斌研究员在工作中给予了重要指导与支持。

中文摘要佐剂作为非特异性免疫增强剂，是灭活疫苗、亚单位疫苗和重组蛋白疫苗等多种疫苗不可或缺的辅助成分。佐剂通过激活和刺激固有免疫细胞，增强机体的适应性免疫应答，从而增强疫苗的免疫原性。佐剂按作用机制主要分为免疫刺激剂和递送系统。此文对目前部分已上市人用疫苗佐剂及新型疫苗佐剂的作用机制及研究进展进行综述，为合理使用现有佐剂及开发新型佐剂提供参考。正文佐剂是非特异性免疫增强剂，可显著增强并延长疫苗诱导的免疫应答或改变免疫应答的类型。作为疫苗的辅助成分，佐剂可减少疫苗中的抗原用量和接种次数，提高疫苗在新生儿、老年人等免疫功能低下人群中的免疫效果。根据作用机制，佐剂主要分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂作为病原体相关分子模式、损伤相关分子模式及其类似物，与APC上的模式识别受体相互作用，诱导APC的激活和成熟，活化的APC向适应性免疫细胞提呈抗原，提供共刺激信号及调控的细胞因子，增加适应性免疫应答。递送系统装载抗原或刺激因子，增加APC对抗原的摄取和提呈能力。本文总结部分已上市人用疫苗佐剂和新型疫苗佐剂增强抗原免疫原性、机体免疫应答的作用机制，以期为进一步研究佐剂的作用机制、合理使用现有佐剂以及设计和开发新型佐剂提供参考。1已上市的人用疫苗佐剂除被广泛使用的铝佐剂外，目前已上市人用疫苗佐剂还包括乳剂型佐剂MF59、AS03；Toll样受体（toll-like receptor，TLR）激动剂型佐剂单磷酰脂质A（monophosphoryl lipid A，MPL）、CpG 1018和CpG 7909；皂苷类佐剂Matrix-M；复合佐剂AS04及AS01等。1.1铝佐剂铝佐剂是使用时间最长、应用最广泛的佐剂，已上市的铝佐剂疫苗包括DTP、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎（乙肝）疫苗、HPV疫苗等。铝佐剂包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾等，常用的为氢氧化铝和磷酸铝。铝佐剂的作用机制复杂，可以作为递送系统发挥储存库效应，增加APC对抗原的摄取，也可以作为免疫刺激剂激活核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3 （nucleotide-binding domain leucine-rich repeat and pyrin domain-containing receptor 3，NLRP3）炎性体，引起Th2型免疫应答，产生IL-1β等细胞因子。1.1.1　储存库效应　大部分学者认为铝佐剂主要通过储存库效应发挥作用。储存库效应指佐剂吸附抗原后，在注射部位缓慢释放，持续刺激免疫系统，从而增强免疫应答。然而，Gupta等采用14C标记破伤风毒素后，将抗原吸附在磷酸铝佐剂并注入小鼠体内，注射部位的抗原在4 h内迅速消除。Hutchison等研究显示，在接种抗原-铝佐剂复合物2 h后，去除接种部位的铝佐剂，对机体产生特异性抗体和T细胞应答没有显著影响。储存库效应的作用机制仍需进一步探究。1.1.2　增加APC对抗原的摄取　氢氧化铝和磷酸铝佐剂免疫小鼠后虽均可在免疫部位募集固有免疫细胞，然而这2种佐剂募集固有免疫细胞的种类有所不同，从而引发不同类型的免疫应答。小鼠实验显示，肌内注射氢氧化铝佐剂主要募集中性粒细胞，而磷酸铝佐剂可将单核细胞和巨噬细胞募集到注射部位，免疫细胞的募集为APC摄取抗原及适应性免疫应答提供了有利条件。铝佐剂还可以与树突状细胞（dendritic cell，DC）细胞膜相互作用。Flach等观察发现，铝佐剂可利用DC细胞膜上的鞘磷脂和胆固醇等脂质维持铝盐与细胞膜的结合，并在铝盐不进入细胞的情况下，将抗原以可溶性的形式递送到细胞中。部分研究提出，铝佐剂对抗原的吸附作用可以将可溶性抗原转化为颗粒形式，由于APC更倾向于摄取颗粒物质，因此铝佐剂可增加DC和巨噬细胞对抗原的摄取。1.1.3　诱导NLRP3炎性体的激活　NLRP3受到刺激后，与凋亡相关斑点样蛋白质和胱天蛋白酶Ⅰ酶原结合，组装成NLRP3炎性体。激活的NLRP3炎性体促使凋亡相关斑点样蛋白质将胱天蛋白酶Ⅰ酶原裂解，裂解产物胱天蛋白酶Ⅰ促进巨噬细胞分泌高水平的促炎细胞因子，如IL-1β和IL-18。这2种细胞因子可以促进CD4+ T细胞分化为Th2细胞，增强免疫应答。研究表明，铝佐剂诱导IL-1β分泌依赖于NLRP3炎性体。铝佐剂诱导宿主细胞死亡释放的宿主DNA或尿酸为内源性危险信号，该信号可以作为损伤相关分子模式激活NLRP3炎性体。1.2乳剂型佐剂乳剂型佐剂根据组成可分为油包水佐剂和水包油佐剂。油包水佐剂以弗氏佐剂为代表，该佐剂在20世纪50、60年代被英国等国应用于流感疫苗中，后因严重的不良反应被撤销使用，目前主要用于动物免疫。水包油佐剂的安全性和耐受性优于油包水佐剂。目前上市的2种乳剂型佐剂MF59和AS03均为水包油佐剂。1.2.1　MF59　MF59主要包含角鲨烯、柠檬酸、吐温80和司盘85。不同于铝佐剂在注射部位形成储存库的作用机制，MF59佐剂形成免疫微环境从而增强免疫应答。研究表明，对小鼠肌内注射MF59会激活注射部位的髓系细胞如巨噬细胞和DC，产生趋化因子，如CC趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）2、CCL4、CCL5、CXC基序趋化因子配体（CXC motif chemokine ligand，CXCL）8。这些趋化因子可募集更多先天免疫细胞，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和DC，增强免疫应答，并促使先天免疫细胞迁移到引流淋巴结，激活B细胞和T细胞。MF59不依赖NLRP3的凋亡相关斑点样蛋白质激活途径和TLR的髓样分化因子88激活途径发挥作用，其激活免疫系统的模式识别受体及信号通路尚待探究。MF59佐剂可诱导较高的Th2型免疫应答，表现出良好的安全性。MF59是继铝佐剂之后第2个被批准用于人类疫苗的佐剂，自1997年MF59被欧洲批准用于流感疫苗后，相继有30个国家批准使用。目前上市的人用疫苗中只有流感疫苗使用MF59。研究显示，含MF59佐剂的不同季节性流感疫苗均具有良好的保护效力和安全性，未发现严重不良事件的风险增加。MF59除了被广泛用于流感疫苗，还被应用于带状疱疹疫苗和HIV疫苗等多种亚单位疫苗。1.2.2　AS03　AS03由角鲨烯、PBS、α-生育酚和吐温80组成。相比于MF59，AS03中的α-生育酚可作为免疫增强成分增加免疫应答。α-生育酚通过参与调节趋化因子和细胞因子（如CCL2、CCL3、IL-6和CXCL1）的表达增强APC对抗原的摄取，并募集先天免疫细胞至引流淋巴结，提高抗体水平。与MF59相似，AS03可诱导小鼠注射部位肌肉和引流淋巴结中细胞因子和趋化因子的产生，并在注射部位募集单核细胞和巨噬细胞，增加抗原摄取。此外，AS03募集单核细胞、DC和粒细胞进入引流淋巴结，增强APC向CD4+ T细胞提呈抗原的能力，通过T-B细胞相互作用，促进B细胞增殖及分化。AS03通常诱导Th2型免疫应答，对Th1型免疫应答的影响较弱。AS03在2009年甲型H1N1流感大流行期间获得欧盟许可被用于流感疫苗；2013年，AS03被FDA批准用于H5N1禽流感疫苗，展示出良好的安全性、反应原性和免疫原性。AS03还被应用于H7N9流感疫苗、乙肝疫苗、COVID-19疫苗等，目前在临床试验中H7N9疫苗的Ⅱ期临床试验（NCT03589807）结果显示，使用AS03佐剂并延长初次免疫-加强免疫间隔时间可显著增强疫苗的免疫应答。1.3TLR激动剂型佐剂TLR是模式识别受体，包括位于细胞膜表面的TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR10和表达在内体膜上的TLR3、TLR7、TLR8、TLR9。TLR识别微生物病原体，启动宿主对感染的免疫应答。MPL来自革兰阴性细菌细胞壁外壁的脂多糖，是TLR4激动剂，主要用于复合佐剂AS01及AS04。CpG 1018和CpG 7909是TLR9激动剂，分别是人工合成的22 bp和24 bp的寡核苷酸，具有硫代磷酸基骨架和未甲基化的CpG寡聚脱氧核苷酸。CpG寡聚脱氧核苷酸可促进MHC、CD40和CD86在浆细胞样DC上的表达，增强抗原加工和提呈。CpG激活TLR9信号通路后，可募集髓样分化因子88、IL-1受体相关激酶和TNF受体相关因子6，激活多种有丝分裂原激活激酶和转录因子，如核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和激活蛋白1，刺激B细胞活化并直接或间接诱导Th1型免疫应答和促炎细胞因子（IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α和IFN-γ）的产生。在特定情况下，CpG可诱导Th2型免疫应答向Th1型免疫应答转换。总之，CpG可以刺激DC成熟，增强Th1型免疫应答并诱导IFN-γ和CD8+ T细胞的产生，还可以加速抗体产生以实现保护性免疫。目前MPL、CpG 1018和CpG 7909均被FDA批准用于人用疫苗。其中，含CpG1018的乙肝疫苗Heplisav-B已在2017年被FDA批准使用，Heplisav-B仅需2剂次注射即可达到免疫效果，而其他已经获得许可并被广泛使用的乙肝疫苗通常需要注射3剂次。与以铝盐为佐剂的乙肝疫苗Engerix-B相比，CpG1018佐剂诱导的抗体应答更为快速和持久。CpG1018还被应用于HIV疫苗、寨卡病毒疫苗、鼠疫疫苗、COVID-19疫苗等，目前在临床试验中。含CpG 1018的COVID-19疫苗的Ⅱ期临床试验（NCT05313035）显示，该疫苗在健康人群中安全性良好、免疫原性较强，能够有效诱导高水平的中和抗体和IgG抗体，并在6个月随访中维持抗体水平。含CpG 7909的炭疽疫苗Cyfendus的Ⅱ期临床试验结果显示，该疫苗具有良好的耐受性和免疫原性，未报告与疫苗相关的严重不良事件。该疫苗于2023年获FDA批准上市。多种TLR激动剂也处于临床前或临床阶段，如TLR3激动剂多肌胞苷酸〔polyinosinic acid-polycytidylic acid， Poly（I：C）〕、TLR4激动剂吡喃葡萄糖脂A、TLR7激动剂咪喹莫特等。1.4皂苷类佐剂皂苷是从多种植物中提取的具有复杂糖骨架的三萜分子。皂苷类佐剂包括从南美皂树的提取物中分离纯化得到的QS-21以及由皂苷、胆固醇、磷脂组成的Matrix-M等。其中，QS-21一般与胆固醇混合使用，以避免QS-21的溶血性、增加QS-21的稳定性，同时将佐剂靶向到吞噬细胞，使其更好发挥其免疫活性。皂苷类佐剂可通过增强抗原递送、增加引流淋巴结中细胞的募集、促进APC交叉提呈、激活炎性体等机制发挥作用。1.4.1　增强抗原递送和增加引流淋巴结中细胞的募集　小鼠肌内单独注射皂苷后，会在注射部位和引流淋巴结中快速产生细胞因子，细胞因子水平在48 h内达到高峰后急剧下降，产生的细胞因子包括IFN-γ、CXCL1、CCL2、CXCL9、CXCL10等。IFN-γ可以促进Th1细胞分化和抗体类别转换，上调DC上MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子的表达，从而促进细胞介导的免疫应答；CXCL1和CCL2募集单核细胞和粒细胞，CXCL9和CXCL10募集T细胞。细胞因子分泌后还会在注射部位和引流淋巴结中募集大量免疫细胞，主要包括单核细胞、DC、中性粒细胞等，对抗原进行摄取加工从而激活T细胞，启动适应性免疫应答。1.4.2　促进APC交叉提呈　Welsby等发现QS-21可以促进单核细胞来源的DC的活化和成熟，增加细胞因子IL-6、TNF-α、IL-8的分泌和CD86、HLA-DR在细胞膜表面的表达。分析表明，QS-21、Matrix-M等皂苷通过胆固醇依赖的内吞作用被单核细胞来源的DC摄取、转运到溶酶体；溶酶体的酸性环境引起Matrix-M中皂苷与胆固醇分离，释放的游离皂苷可使溶酶体膜不稳定；溶酶体中的酶及摄入的抗原被释放到APC的细胞质中，使外源性抗原在细胞质中被进一步处理，实现交叉提呈。交叉提呈使DC可将外源性抗原通过MHC Ⅰ类分子提呈给CD8+ T细胞，攻击和破坏被感染的宿主细胞，有助于抵御病毒和其他细胞内病原体。1.4.3　激活炎性体　皂苷类佐剂会引起APC中溶酶体的破裂，将抗原及溶酶体中的成分释放到细胞质中，可能会诱导炎性体的激活。Marty-Roix等在体外使用QS-21与MPL共刺激巨噬细胞和DC后发现，QS-21与MPL联用引发NLRP3依赖性炎性体激活，分泌IL-1β和IL-18，介导Th17细胞的成熟或刺激IFN-γ的产生，从而诱导Th1型免疫应答。由于与野生型小鼠相比，使用含QS-21的疫苗免疫的NLRP3缺陷型小鼠的Th1和Th2型免疫应答水平及IgG1和IgG2c抗体滴度都更高，因此其作用可能还涉及其他信号通路。目前，以 Matrix-M 为佐剂的COVID-19疫苗NVX-CoV2373及疟疾疫苗R21/Matrix-M已分别被FDA及WHO批准使用。NVX-CoV2373的Ⅲ期临床试验显示，在健康成年人中，接种2剂次对新型冠状病毒感染的保护率为89.7%，对Alpha变异株的保护率高达86.3%。R21/Matrix-M的临床试验结果显示，5~17月龄儿童3次免疫后1年内对疟疾的保护率为77%。除已上市的2种疫苗外，含Matrix-M佐剂的疫苗，如呼吸道合胞病毒疫苗，已进入临床试验阶段。1.5复合佐剂复合佐剂是将2种及以上的免疫增强剂联合使用的佐剂，同时实现抗原递送和免疫刺激，在发挥各组分优点的同时，最大程度地发挥佐剂效应，增强免疫应答。开发复合佐剂是目前佐剂研究和发展的趋势。已上市的人用疫苗佐剂中，乳剂型佐剂MF59和AS03、皂苷类佐剂Matrix-M均为复合佐剂。此外，复合佐剂还包括含TLR激动剂的AS01、AS04。AS佐剂系统是由英国葛兰素史克公司于20世纪80年代末开发的复合佐剂系统，将经典佐剂分子如铝盐、乳剂等与免疫刺激分子合理组合，有效激活免疫应答。1.5.1　AS04　AS04由MPL吸附至铝盐制成。小鼠实验显示，AS04可以激活表达TLR4的APC，快速引起注射部位肌肉和引流淋巴结中细胞因子的产生和免疫细胞的募集，接种24 h内可以观察到摄取抗原的单核细胞和DC数量显著增加，并引起T、B细胞活化，诱导强烈且持久的体液和细胞免疫应答。通过对比接种MPL和AS04组小鼠的结果发现，铝盐与MPL虽无协同作用，但铝盐的存在延长了MPL在注射部位诱导的细胞因子的反应时间。AS04的免疫刺激作用主要依赖TLR4，与其他TLR不同，TLR4可以激活2种信号通路，既可以通过髓样分化因子88途径激活NF-κB，诱导TNF-α和IL-6等促炎细胞因子分泌，刺激APC成熟，从而增强适应性免疫应答；也可以通过Toll/IL-1受体结构域衔接蛋白传递信号，激活IFN调节因子（IFN regulatory factor，IRF）3，从而产生少量的IFN-γ，诱导Th1型免疫应答。相比铝佐剂，AS04可诱导更强的免疫应答，并使Th1/Th2型免疫应答更加平衡。AS04已被FDA批准用于HPV疫苗和乙肝疫苗，其中，二价HPV吸附疫苗Cervarix是FDA在2009年批准的首个含AS04佐剂疫苗。长期随访数据显示，Cervarix对宫颈癌前病变具有较高且持久的预防效果，在初次免疫9年后，疫苗效力接近甚至达到了100%。1.5.2　AS01　AS01是由QS-21、MPL、二油酰基磷脂酰胆碱和胆固醇组成的脂质体佐剂，含MPL和QS-21 2种免疫刺激剂，二者共存可消除QS-21的溶血活性。脂质体是安全有效的疫苗佐剂递送系统，具有低反应原性的特点，能够携带多种抗原及佐剂，保护抗原免受降解。同时，脂质体还能将抗原靶向至免疫细胞甚至细胞器，产生溶酶体逃逸，促进抗原交叉提呈，从而增强疫苗接种效果。MPL和QS-21之间具有协同效应，使AS01激活新的信号通路，而单一组分无法激活该信号通路。接种含AS01佐剂疫苗的数小时内，在IL-12、IL-18和巨噬细胞的参与下，MPL和QS-21的协同作用会引起引流淋巴结中的细胞（主要是自然杀伤细胞）快速产生IFN-γ，促进DC的活化及Th1型免疫应答。此外，接种AS01佐剂的小鼠分泌IFN-γ、IL-2的CD4+ T细胞的数量远高于接种仅含单独成分佐剂的小鼠，表明QS-21与MPL联合使用可促进抗体应答和抗原特异性CD4+ T细胞应答。英国葛兰素史克公司研发的含有AS01的重组带状疱疹疫苗Shingrix于2017年获FDA批准。临床试验结果显示，AS01佐剂能够促进先天免疫应答，疫苗保护率高达97%。此外，以AS01为佐剂的RTS，S/AS01疟疾疫苗Mosquirix也被欧洲药品管理局批准使用。Ⅲ期临床试验（NCT00866619）结果显示，RTS，S/AS01对6~12周龄新生儿疟疾感染的有效性为26%，对5~17月龄儿童疟疾感染的有效性为36%。2新型疫苗佐剂目前使用的佐剂虽能引起强烈的体液免疫应答，却很少能引起CTL应答，且现有佐剂不能引起机体对许多病原体，如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等的保护作用。新型佐剂的开发至关重要。目前已有新型免疫刺激剂和递送系统显示出良好的佐剂效果，如Poly（I：C）、CF501、Mn2+、环二核苷酸（cyclic dinucleotide，CDN）等。2.1Poly（I：C）Poly（I：C）是人工合成的双链RNA（double-stranded RNA， dsRNA）类似物，主要作为TLR3激动剂，激活APC参与免疫应答。TLR3识别Poly（I：C）后会形成二聚化的TLR3-dsRNA复合物，TLR3二聚体募集接头蛋白Toll/IL-1受体结构域衔接蛋白，激活NF-κB和IRF3等转录因子。由于TLR3主要位于内体膜，无法对细胞质中的Poly（I：C）进行识别，因此细胞质中dsRNA的应答主要依靠黑色素瘤分化相关基因5和维甲酸诱导基因Ⅰ。体外实验证明，Poly（I：C）可以诱导单核细胞来源的DC的成熟和活化，促进IFN-β、IL-6和IL-12p70的分泌。Poly（I：C）还可以促进外源性抗原向CD8+ T细胞交叉提呈，并诱导Th1型免疫应答。交叉提呈使DC在细胞外摄取外源性病原体后，通过MHC Ⅰ类分子提呈给CD8+ T细胞，启动CTL免疫，这对依赖细胞免疫的疫苗至关重要。Poly（I：C）除激活免疫细胞成熟、产生免疫应答外，还可以刺激一系列非造血细胞产生Ⅰ型IFN和促炎细胞因子，并上调MHC Ⅰ类分子在非造血细胞表面的表达。在病毒感染期间，非造血细胞MHC Ⅰ类分子表达的上调，可以增强细胞内抗原向病毒特异性CTL的提呈，有助于识别感染细胞和防止细胞内病原体的传播。总之，Poly（I：C）可以有效诱导多种APC成熟，分泌IL-12、IFN-β等Th1型细胞因子，诱导Th1型免疫应答和CTL的活化。含QS-21和Poly（I：C）的脂质体佐剂MA105是成都迈科康生物科技有限公司自主研发的新型佐剂系统，被应用于重组带状疱疹疫苗 。Ⅰ期和Ⅱ期临床试验（NCT05636436、NCT05856084）结果表明，该佐剂具有良好的安全性、耐受性和免疫原性。目前该MA105佐剂疫苗已进入Ⅲ期临床试验（NCT06447779）。2.2CF501CF501是新型非核苷酸小分子IFN基因刺激因子（stimulator of IFN gene，STING）激动剂。STING信号通路的活化起始于胞内DNA与环鸟苷酸-磷-腺苷一磷酸（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP）合酶（cGAMP synthase，cGAS）结合，cGAS构象变化并二聚化，活化的cGAS促进2'，3'-cGAMP合成，2'，3'-cGAMP作为STING二聚体的配体激活STING。CF501直接激活STING从内质网向高尔基体易位，释放C端尾部及聚合。被释放的C端尾部招募TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1），TBK1自磷酸化并磷酸化STING，IRF3被磷酸化的STING募集并被TBK1活化，磷酸化的IRF3二聚体转移到细胞核中促进Ⅰ型IFN的表达。与传统的STING激动剂cGAMP相比，CF501在处理人单核细胞白血病细胞后，与STING信号通路有关的蛋白STING、TBK1和IRF3的磷酸化水平更高，可以更有效地激活STING信号通路。体外及动物实验均证明，CF501可以快速有效地激活先天免疫应答，产生高水平的IFN-β、IL-6、CXCL10等细胞因子，肌内注射含CF501佐剂的疫苗可诱导高滴度的IgG2a，强烈激活Th1型免疫应答。CF501作为新型STING激动剂，在小鼠、家兔、恒河猴实验中均表现出良好的免疫增强效应，诱导产生高滴度交叉中和抗体，展现出良好的安全性。CF501为疫苗佐剂提供了新选择，目前该佐剂尚未进入临床试验阶段。2.3Mn2+锰在发育、繁殖、神经元功能、免疫调节和抗氧化防御等多种生理过程中起重要作用。Wang等研究发现Mn2+在宿主防御病毒时起着至关重要的作用。病毒感染机体后，Mn2+从细胞器中释放，与cGAS结合，增加cGAS的双链DNA敏感性和酶活性，并增强cGAMP-STING结合的亲和力，从而增强STING的活性。Zhang等发现Mn2+通过激活cGAS-STING信号通路促进DC成熟和活化，诱导小鼠骨髓来源DC产生IFN-β和IFN-α，并引起细胞表面CD80、CD86、CCL2等共刺激因子和趋化因子的显著上调。除激活DC外，Ouyang等开发的锰纳米颗粒可以激活多种APC亚群，包括1型经典DC、2型经典DC、浆细胞样DC、M1型巨噬细胞，保护小鼠免受高剂量鼠疫杆菌的侵袭。与铝佐剂相比，Mn2+对NLRP3炎性体的激活效应更为显著，并诱导产生IFN-β。Mn2+还可以促进抗原提呈及CD8+ T细胞和自然杀伤细胞活化。Lyu等的研究显示，小鼠经Mn2+处理后，CD8+ T细胞中TNF-α和IFN-γ的表达显著提升，CD44hiCD8+ T细胞数量显著提高，产生了更多的记忆CD8+ T细胞。锰及其衍生物具有潜在的佐剂活性，可通过增强cGAS-STING先天免疫通路，诱导Ⅰ型IFN的产生，增强抗原提呈和交叉提呈，增强CTL免疫应答，从而提高机体的免疫效果。目前，锰及其衍生物在临床试验中被用于多种肿瘤的免疫治疗，但尚未有单独以锰作为佐剂的预防型疫苗进入临床试验阶段。2.4CDNCDN是原核生物和真核生物中广泛存在的信号分子，分为天然CDN和合成CDN，天然CDN主要有4种，分别为c-di-GMP、c-di-AMP、2'，3'- cGAMP、3'，3'-cGAMP。CDN可以靶向并激活cGAS-STING通路，激活IRF3和NF-κB，参与调节和控制多种重要的生物过程。CDN可诱导中性粒细胞和巨噬细胞在局部快速和短暂地募集，并诱导趋化因子CXCL1、CCL2、CCL3、CXCL2和CCL5的产生。除募集固有免疫细胞外，CDN还可通过胞饮作用和受体介导的内吞作用增强CD11c+细胞对抗原的摄取，诱导DC激活和成熟，提高共刺激分子（CD80、CD86）及成熟标志物（CD83和MHC Ⅱ类分子）的表达，促进IL-12、IFN-γ、IL-8、CCL2、CXCL10等细胞因子的产生。此外，CDN独立于STING信号通路，通过细胞内感染识别相关途径激活NLRP3炎性体，刺激IL-1β的产生。研究表明，CDN可诱导DC交叉提呈，诱导CTL应答，诱导机体产生平衡的Th1/Th2/Th17型免疫应答。CDN可以诱导平衡且持久的体液、细胞免疫应答，是用于疫苗广泛保护机体免受病原体感染的潜在理想佐剂。目前，以c-di-AMP为佐剂的HPV疫苗正在进行Ⅰ期临床试验（NCT05208710）。3总结及展望免疫刺激剂通过靶向特异性模式识别受体激活APC，增强抗原提呈和共刺激信号，从而增强适应性免疫。已获批的TLR9激动剂CpG 1018、CpG 7909与TLR4激动剂MPL，均可通过信号转导激活多种转录因子，诱导细胞因子及调控因子产生。递送系统则主要增加机体对抗原的利用，如乳剂型佐剂MF59和AS03可以促进固有免疫细胞向淋巴结转移，增强APC向T细胞提呈抗原的能力；皂苷类佐剂还可以促进抗原的交叉提呈，诱导CTL应答。联合免疫刺激剂与递送系统是当前佐剂开发较有前景的策略之一。递送系统不仅可以保护免疫刺激剂和抗原免受降解，还可以将其直接递送到靶细胞。除已获批的AS01和AS04采取联合使用外，还有多种联合佐剂配方处于临床前和临床研究阶段。免疫增强剂的联合使用不仅可以发挥各自的功能，还有可能产生协同作用。基于此，在设计和使用疫苗佐剂时，可以通过合理地联合使用多种免疫增强剂，同时激活多个受体及信号通路，在减少佐剂不良反应的情况下，诱导固有免疫细胞、适应性免疫细胞等多种细胞参与免疫应答，并形成长久的免疫记忆。综上所述，深入研究佐剂的作用机制，全面了解其对免疫系统的影响，可为安全有效地使用佐剂增强机体免疫应答、新型高效佐剂的开发及其临床应用提供理论基础。使用佐剂时，应综合考虑佐剂的安全性、有效性、可及性、可控性以及稳定性，减少不良反应的发生，便于生产和使用。此外，基于佐剂研究多学科交叉特性，系统融合不同学科知识，扬长避短，可为开发更为安全有效的新型佐剂提供指导。作者孙佳  李树香国药中生生物技术研究院有限公司第三研究室， 北京 101111 通信作者：李树香，Email：lishuxiang@sinopharm.com

本内容于2025年9月发表在《中国兽医杂志》，文章通过从病原学检测、血清学检测和分子生物学检测方面综述了国内外ASFV检测方法的研究进展，为ASFV的科学防控提供参考，分享给感兴趣的同行阅读。SCI猪病研究，带着偏见读文献！摘要：非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种高度接触性传染病，以猪的网状内皮系统感染、高热、全身性出血等为主要临床特征，严重威胁全球养猪业可持续发展。目前尚无确实安全有效的ASF疫苗和抗病毒药物，生物安全仍是该病防控的主要和首要措施。疫病防控，检测先行，对ASFV进行及时、高效、准确的检测和监测是其生物安全防控的关键环节。本文从病原学检测、血清学检测和分子生物学检测3个方面综述了国内外ASFV检测方法的研究进展，以期为其科学防控提供参考。关键词：非洲猪瘟（ASF）；非洲猪瘟病毒（ASFV）；检测方法非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的猪的一种高度接触性传染病，以网状内皮系统感染、高热和全身性出血等为典型临床特征。自 1921 年肯尼亚首次报道 ASF疫情以来，该病在全球多个国家呈地方性流行，严重制约养猪业的健康发展。2018年，基因II型ASFV传入我国并在短时间内迅速扩散，重创我国生猪产业。随后，ASFV 基因II型缺失毒株、基因I型毒株在我国田间陆续出现。更为严峻的是，2021年左右出现的ASFV基因I/II型重组毒株突破了以II型毒株为基础研制的减毒疫苗的保护作用，并且已逐步取代基因II型强毒株成为主流毒株。当前，我国ASFV流行毒株呈现“多谱系、多时空”的复杂态势，使其防控面临更加严峻挑战。目前，尚无确实安全有效的ASF疫苗获批应用，生物安全体系构建仍是疫病防控的核心策略。疫病防控，检测先行，建立及时、高效、精准的ASFV检测监测体系，是生物安全防控的关键环节。ASF与经典猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪丹毒、仔猪副伤寒、猪伪狂犬病和猪肺疫等疫病具有相似的临床症状，仅通过临床观察或尸体剖检难以进行鉴别诊断。因此，ASF的确诊不能仅依赖临床诊断，还需结合实验室诊断手段开展综合判定。目前，确诊ASF疑似病例通常需要结合至少2种实验室检测方法，例如同步检测疑似感染动物的病毒核酸和特异性抗体。在众多方法中，基于聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）方法检测病毒核酸被公认为是一种极为有效且实用的ASFV诊断方法。血清学检测是 ASFV流行病学调查的重要工具，可用于追溯病原侵入猪群或野猪种群的时间节点。其中，酶联免疫吸附试（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）因操作便捷，成为实际生产中检测ASFV抗体的主流方法。本文系统综述了国内外已报道的ASFV实验室检测方法，对比分析了不同方法的特点和应用局限，以期为我国ASF的综合防控策略制定提供科学参考。1 病料采集ASFV检测的样品采集需结合检测目的、样品病毒含量、不同监测场景和检测方法特性采取差异化的采样策略，注重规范性和质量控制，以确保检测的准确性。  1.1 样品类型选择根据检测方法（血清学检测、核酸检测等）和病程阶段，优先选择病毒含量高、代表性强的样品。核酸检测优选样品：发病初期猪只的脾脏、扁桃体等内脏器官，病毒含量高的样品是核酸检测（如PCR等）的首选；血液、由淋巴结、肝脏等器官制备的组织液也常用于核酸检测，适用于病毒血症期的样品采集。抗体检测样品：血清、口腔液或口鼻分泌物适合采用血清学检测（如ELISA等），可反映机体免疫应答状态，但需注意感染后抗体产生存在滞后性（不适用于潜伏期检测）。现场快速检测样品：口腔拭子、直肠拭子、全血等，操作便捷，适合基层或现场快速筛查，但需注意这类样品病毒含量较低，可能导致假阴性。特殊场景样品：厨余垃圾、饲料粉尘、环境拭子等可用于追溯病毒传播途径（如饲料污染），需结合富集技术提升检测灵敏度。不同类型样品采样要求见表1。1.2 采集规范和质量控制样品采集需使用一次性器皿（如离心管、拭子等），严禁重复使用，同时应及时更换手套以减少交叉污染，脏器样品需在无菌环境下采集以避免杂质干扰；发病初期优先采集脾脏、淋巴结等高病毒载量组织，亚急性或慢性病例可采集血液、扁桃体等样品，对疑似感染猪只建议同时采集多种样品（如脾脏和血清）以提高检出率；采样后需立即冷藏（4 ℃短期保存）或冷冻（−20 ℃及以下长期保存），全程冷链运输以避免高温导致病毒核酸或抗原降解，拭子样品需浸入专用保存液防止干燥；此外，采样时需详细记录样品信息（包括采样时间、猪只编号、样品类型、采集部位和储运条件等），建立可追溯体系以便后续结果复核和疫情追溯。综上，ASFV检测样品采集的核心是“选对样品、规范操作、严控质量”，需根据检测场景灵活选择样品类型，并通过全程质控减少干扰因素，为准确诊断提供可靠基础。 2 病原学检测方法2.1 红细胞吸附试验（Hemadsorption test，HAD） HAD的原理为ASFV 感染的猪巨噬细胞或单核细胞可吸附猪红细胞，从而呈现“玫瑰花环”现象。目前尚未发现其他猪源病毒具有类似特性，因此该检测方法对ASFV具有高度特异性。尽管该方法特异性强、敏感性高，但存在操作流程繁琐、检测周期较长的局限性。此外，部分 EP402R突变或缺失的ASFV基因II型和基因I型毒株，无法产生红细胞吸附现象，导致该方法对这类毒株不适用。2.2直接免疫荧光试验（Direct immunofluorescence test，DIF） DIF是利用荧光标记抗体检测样品中ASFV的方法。该方法具有操作简便、检测耗时短的特点，同时兼具良好的特异性和敏感性，具体应用场景包括：病理组织中ASFV抗原的定位检测、不产生红细胞吸附现象的ASFV毒株鉴定，以及细胞培养时ASFV所致细胞病变的辅助判定。然而，该方法存在以下局限性：在亚急性型和慢性型ASF病例中，DIF检测灵敏度会显著下降；此外，受限于技术原理，DIF难以实现高通量批量检测，且试验所需的高特异性ASFV荧光标记抗体存在制备难度大、获取成本高的问题。2.3以病原为检测对象的 ELISA ELISA 由Engvall 和Perlmann 在1971年首次提出，该方法基于抗原-抗体特异性结合原理和酶对底物的高效催化特性，可实现对样品中抗原、抗体或其他生物分子的定性检测和定量分析。1997 年，Vidal 等使用ASFV p72 蛋白的单抗建立了1种夹心ELISA 检测方法，灵敏度可达2. 3 × 102 PFU/mL。 2006年，Hutchings 等建立了 2 种检测ASFV 的间接夹心ELISA，发现采用多克隆抗体包被时的检测灵敏度显著优于单克隆抗体包被。尽管这类以抗原为检测靶标的ELISA方法适用于大规模样品筛查，但其灵敏度低于HAD 和PCR 。3 血清学检测方法3.1 以抗体为检测对象的ELISA 在ASF暴发早期，感染动物多表现为急性或亚急性病程，死亡率高，此时常采用分子生物学检测方法快速检出病毒，以实现疫情的早期控制。但随着疫情持续，ASFV变异毒株不断出现，越来越多的感染动物呈现隐性感染状态，甚至不表现任何临床症状。ASFV感染可诱导猪体迅速产生特异性抗体，且抗体可维持数月至数年。在未使用ASFV疫苗的前提下，抗体检测阳性即表明动物群体已被病毒感染。因此，ASFV抗体检测成为大规模流行病学筛查的关键手段，可有效补充分子生物学检测在隐性感染群体中的监测盲区。ELISA是检测ASFV抗体的经典方法，目前主流的ASFV抗体ELISA 检测方法包括:（1）包被单一蛋白的间接ELISA。Chen等以真核表达的 ASFV p30为包被抗原，建立了1种间接ELISA检测方法，最低可检测到 1∶12 800 稀释的ASFV阳性血清。Wu等将ASFV p15与弹性蛋白样多肽（Elastin-like polypeptide）融合表达后再切除，得到了无标签的 p15，以其为包被抗原建立间接ELISA 检测方法，最低可检测到1∶1 600稀释的ASFV阳性血清。另外，还有一些检测方法将多个ASFV蛋白（如 p72、p54 和 p30）的优势抗原表位串联，设计新型抗原表位重组蛋白进行包被，基于此类重组蛋白建立间接ELISA检测方法，其最低可检测到1∶6 400稀释的ASFV阳性血清。（2）包被多种蛋白的间接ELISA。Zhou等基于ASFV p30 和 pB602L 建立了双抗原间接ELISA检测方法，最低可检测到1∶1 600 稀释的ASFV 阳性血清。Jung 等建立了1 种基于CD2v、CAP80（pB602L）、p54 和p22的间接ELISA检测方法。（3）双抗原夹心ELISA。通过原核表达并纯化ASFV p30 或者真核表达ASFV p72，将蛋白标记辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP），建立双抗原夹心ELISA检测方法，最低可检测到1∶1 280稀释的ASFV阳性血清。（4）阻断ELISA。Tesfagaber 等基于ASFV p72及其单抗，建立了阻断ELISA检测方法，可在ASFV 感染7~9d检出抗体。（5）竞争ELISA。研究人员筛选出针对ASFV p30和pK205R的纳米抗体，将编码该纳米抗体的基因与HRP基因连接，表达获得纳米抗体-HRP融合蛋白，以此建立竞争ELISA检测方法，最低可检测到1∶320稀释的ASFV阳性血清。以抗体为检测对象的ELISA方法灵敏度高、成本低廉，适用于大规模筛查，但因其耗时较长、操作复杂而不适用于现场快速检测。 2 侧流层析试验（Lateral flow assay，LFA）LFA是1种基于抗原-抗体特异性反应原理，借助层析技术快速检测样品中目标分析物的诊断方法，其检测结果多以试纸条形式呈现。2022年，Geng 等在检测试纸条的结合垫上添加胶体金标记的ASFV p72，检测线和质控线上分别固定金黄色葡萄球菌蛋白A和p72抗体，建立了检测ASFV抗体的方法，其灵敏度优于市售商品化试剂盒，为现场快速筛查提供了更优选择。除胶体金外，量子点、荧光微球等材料也被用于开发检测ASFV的试纸条。蛋白的选择方面，除ASFV p72外，p54、pp62、p30和融合蛋白也被应用于LFA。LFA方法优势在于操作简便、反应快速、成本较低，但灵敏度相对有限。ASFV现有血清学检测方法原理总结见图1。4 分子生物学检测方法4.1 普通PCR和巢式PCR PCR是通过扩增病毒特定基因片段以判断样品中是否存在目标病毒的检测方法。为提升检测效率，研究人员开发了可同时检测ASFV和猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）的双重PCR检测方法，以及可同时检测ASFV、CSFV、猪圆环病毒2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）和猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）的五重PCR检测方法。巢式PCR（Nested polymerase chain reaction）检测原理与普通PCR基本一致，其核心是反应体系中包含2对引物，其中1对引物的结合区域位于另1对引物扩增产物的内部，这种嵌套式扩增设计提升了该方法的敏感性和特异性。2006年，Basto等首次将巢式PCR用于ASFV检测，其灵敏度优于当时世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health，WOAH）推荐的普通PCR方法。针对巢式PCR 存在加样过程中容易出现交叉污染的缺点，Milton等在2024年开发了一管式巢式PCR技术，该方法以ASFV B646L基因为检测对象，检测限可达100拷贝/反应。普通PCR和巢式PCR的灵敏度高、特异性好，但需通过核酸电泳判定检测结果，不适用于大规模检测。4.2 实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitativePCR，qPCR）qPCR是在PCR 反应体系中加入荧光基团，通过实时监测荧光信号变化反映PCR产物的累积量，进而实现对起始模板定量和定性分析的技术。2010年以来，ASFV的qPCR 检测技术持续发展：2010年，McKillen 等针对B119L基因开发了基于小沟结合物的新型探针ASFV检测方法。2013年，Fernández-Pinero 等以B646L 基因为靶标，结合罗氏公司通用探针库建立了灵敏度低于18拷贝/反应的ASFV检测体系。后续研究进一步优化性能和拓展应用，2020年，Wang等开发了冻干试剂型B646L基因检测方法，该方法成本低且灵敏度优于WOAH 推荐方案。2022年，Wu等通过结合富集系统实现了水中ASFV的高效检测。2023年，Qian等建立了三重qPCR，可区分基因I 型和II 型ASFV，Hwang等则开发出仅需50min且覆盖所有24个基因型的快速ASFV检测方法。qPCR的灵敏度高于普通PCR和巢式PCR，检测结果可通过荧光信号直接呈现，被广泛应用于大规模筛查，但该方法对仪器设备要求较高，操作相对复杂。4.3 微滴数字PCR（Droplet digitalPCR, ddPCR）ddPCR由Hindson 等于2011年提出，该技术将核酸样品分割至众多微滴反应单元，经PCR扩增后对微滴内的荧光信号进行统计分析，从而实现核酸的绝对定量。作为第3代核酸检测技术，ddPCR能对样品中核酸进行绝对定量，在低拷贝样品检测中也表现优良。2018年，Wu等针对ASFV K205R 基因建立了ddPCR检测方法，检测下限为10拷贝/反应。此外，针对EP402R基因缺失的无血凝活性的基因II 型ASFV，Zhu等基于ASFV B646L 和EP402R基因，建立了双重ddPCR检测方法，用以区分ASFV EP402缺失型毒株与野生型毒株。4.4 环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）LAMP是Notomi 等于2000年提出的新型核酸扩增技术，其利用4种特异引物，借助链置换DNA聚合酶，在60~65℃等温条件下特异高效扩增DNA。2010年，James 等针对ASFV P1192R 基因建立了LAMP 检测方法，检测限为330拷贝/反应，结果可通过传统核酸凝胶电泳读取，还可借助qPCR仪或试纸条等读取。2020年，Wang 等针对ASFV K78R基因建立了实时LAMP 和可视化LAMP检测方法，两者检测限均为30copies/µL。2022年，Wang等针对ASFV B119L 基因建立的实时LAMP检测方法，检测限达13copies/µL。在联用技术方面，Ji 等将LAMP与微流控结合，建立了可同时检测基因缺失型ASFV、野生型ASFV、PPV、PCV2和PRRSV 的方法；Zhu等通过将蜂巢芯片与LAMP结合，实现了对ASFV B646L、B962L、C717R、D1133L和G1340L五个基因的同步检测；Yuan等构建了基于LAMP的铋诱导增强光电化学生物传感器，通过检测光电流变化对ASFV进行定量分析；Sun等在LAMP 和LFA 方法基础上集成微加热系统，进一步提升检测效率。此外，Wang等利用LAMP 反应中会生成大量焦磷酸，导致反应体系pH值改变的特性，将LAMP与酸碱指示剂中性红结合，建立了可视化的检测方法。除传统pH指示剂外，碳纳米点（Carbon  nanodots，CNDs）也可以作为酸碱指示剂。2022年，Cao 等以ASFV B646L基因为检测对象，将LAMP与CNDs结合，建立方法的检测灵敏度可达15.21copies/µL。作为新型核酸扩增技术，LAMP 具有灵敏度高、反应速度快、反应条件温和等优势，但该方法的引物设计较为复杂。5重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification, RPA）和重组酶介导扩增（Recombinase aided amplification, RAA）RPA是Piepenburg等于2006年提出的等温核酸扩增技术，能在恒定温度下实现对特定核酸序列的快速扩增。针对ASFV B646L基因建立的实时RPA检测方法，检测限为3.5~100copies/µL。以ASFV CP204L基因为检测靶标建立的RPA检测方法灵敏度可达50拷贝/反应，且全过程仅需6min。RPA方法经常与LFA联合，以实现便携的可视化检测。2019年，Miao等建立的RPA-LFA检测方法以ASFV B646L基因为检测对象，检测限为150拷贝/反应。2020年，Zhai等开发的RPA-LFA 联合方法以ASFV K205R基因为检测对象，检测限为100拷贝/反应，灵敏度与qPCR相当。2021年，Wang等建立的针对ASFV B646L基因的RPA-LFA检测方法，检测限为100copies/µL。此外，Zhang等在RPA反应体系中添加SYBR Green I核酸凝胶染色剂，通过肉眼观察颜色变化即可判断检测结果。2010年，吕蓓等对RPA进行优化，提出RAA 技术。基于此，Wu等建立针对ASFV B646L基因的实时检测方法，检测限为1 000 拷贝/反 应。2021年，Wang 等利用等温荧光扩增仪开发便携式实时RAA 方法，将检测限降至10拷贝/反应。RAA与LFA的联用技术持续发展：2021年，Zhang等建立检测ASFV B646L 基因的RAA-LFA检测方法，检测限达10 copies/µL；2022年，Wen等以ASFV B646L 基因为检测靶标，在LFA中用量子点作为显色粒子，实现了便携可视化检测，最低可识别含1拷贝ASFV基因的质粒；2023年，Zhou等在RAA体系中添加核酸外切酶III和特异性探针，不仅将检测灵敏度提升至2copies/µL，还可通过颜色变化实现可视化判读。相较于LAMP，RPA和RAA技术具有引物设计更简便、反应条件更温和的优势，但因成本较高限制了其在大规模筛查场景中的应用。4.6 基于CRISPR-Cas系统的核酸检测方法规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short  palind-romic repeats, CRISPR）核酸检测技术基于CRISPR相关蛋白（CRISPR-associa-ted protein，Cas）的特异性识别和切割功能：Cas 结合靶核酸后激活非特异性切割活性，高效降解报告分子，通过信号变化实现对目标序列的高灵敏度检测。Yang等将CRISPR-Cas12a与LAMP结合，建立了ASFV检测方法，检测结果通过紫外光源照射判读，对ASFV B646L基因的最低检测限达7 copies/µL。除B646L 外，还有以KP177R、D117L等基因为检测靶标的基于CRISPR-Cas 系统的ASFV核酸检测方法。除单基因检测外，研究人员还开发了基于CRISPR-Cas系统的多靶点检测方法。利用CRISPR-Cas12b 和CRISPR-Cas13a 分别检测ASFV MGF505-2R 和B646L基因，通过试纸条和紫外光源照射判读检测结果，且能区分野生型ASFV 和MGF505-2R缺失型ASFV。此外，Zeng等在CRISPR-Cas12a 系统中引入多个crRNA，建立针对单基因（如B646L）多位点的检测方法，该方法无需核酸扩增即可检测到低至1 pmol/L的靶标基因。基于CRISPR-Cas系统的核酸检测结果判读方式多样：最常见的是通过紫外光源照射或试纸条；此外，还可通过肉眼观察颜色变化实现。例如，Ki等利用脲酶催化显色反应指示CRISPR-Cas12a的检测结果；Mao等将CRISPR-Cas12a与RPA结合，通过碱性磷酸酶催化显色判读结果；Zhao等利用CRISPR-Cas14a系统结合G-四联体/氯化血红素（G-quadruplex/hemin）脱氧核酶催化显色完成检测；Zhu等构建了基于CRISPR-Cas12a的金纳米颗粒（Gold nanoparticles,Au-NPs）网络比色传感平台，通过颜色变化判读结果。ASFV现有分子生物学检测方法原理总结见图2。5 总结与展望本文系统梳理了ASFV 的三大类检测技术体系，包括病原学检测、血清学检测和分子生物学检测方法，各技术的性能特点和应用局限总结见表2。现有ASFV检测方法仍存在灵敏度不足、高通量效率有限等问题，研究人员正开发高通量、智能化等新型技术，推动检测向精准高效升级。近年来，纳米材料（石墨烯、AuNPs、量子点等）与生物传感结合，优化了检测性能，具无需标记、信号放大、微型化等优势，克服了传统方法对大型设备的依赖，为现场检测提供新方案。例如，Wang等将石墨烯场效应晶体管（Graphene field-effect transistor, G-FET）与CRISPR-Cas12a耦合，无需核酸扩增即可实现0.5 amol/L 检测限，30 min 内区分ASFV 基因I 型和II 型毒株；Zhu 等将金纳米颗粒AuNPs 与CRISPR-Cas12a 系统结合，构建可视化检测平台，实现“ 样 品 进 -结 果出 ”的 一 步 法 检 测 ，检 测 限 为0.1 copies/µL，且具备显著的现场检测适应性；Zhou等开发的基于量子点的侧向层析（Quantum dot-based lateral flow assay，QDs-LFA）试纸条，可同时检测ASFV pp62 抗体和CSFV抗体，适用于现场混合感染的快速筛查。不同检测方法的性能比较如表3所示。值得关注的是，ASFV基因I型和II型重组毒株已逐步成为主流毒株，对现有ASFV 检测方法的稳定性和准确性构成挑战。多数分子生物学检测方法（如qPCR、RPA 和LAMP 等）靶向ASFV 保守基因（如B646L），但单一靶点的检测面对新型变异毒株存在“假阴性”风险，因此研究人员建议采用多靶点联合检测策略以提升检测的可靠性。Hu等建立的双重荧光定量PCR方法靶向ASFV MGF_110-1L 和O61R基因，可有效区分基因I型、基因II型和基因I/II 型重组毒株。血清学检测方法（如ELISA 和LFA）多以p30、p54 或pp62 等蛋白作为抗原识别位点，然而部分重组毒株可能在这些抗原区域发生抗原漂移，进而影响检测。因此，未来ASFV检测方法的靶标设计需更加关注保守性、多位点协同识别和变异区域避让，以提升检测体系对病毒变异的适应性。为进一步提升ASFV检测方法的灵敏度、特异性和现场适用性，研究人员正在探索多元优化策略。以纳米材料界面工程为例，通过表面修饰调控可显著降低非特异性吸附干扰。Yuan等开发的光电化学生物传感器通过对材料界面的调整有效提升了检测精度。此外，将人工智能和图像识别算法嵌入试纸条判读和电信号分析，有助于规避人工判读的主观误差，提高结果一致性。低成本制造技术的推进也为新型检测平台的规模化生产提供了工艺基础。这些以材料科学、生物识别技术和微系统工程为核心的多学科交叉策略，将加速推动ASFV检测技术向高灵敏、高特异、低成本、全自动化、现场即时化的五代检测体系迭代升级。

　　近日，中国农业科学院兰州兽医研究所（以下简称“兰兽研”）联合广东省农业科学院动物卫生研究所等单位共同申报的“猪重要细菌病精准防控技术创新与集成应用”项目，已获2025年度国家科学技术奖提名。　　在副猪嗜血杆菌病防控技术及产品研发领域，兰兽研科研团队经过了15年的持续攻关，取得重大突破，相关科研成果荣获2024年度甘肃省科技进步奖一等奖。　　副猪嗜血杆菌病是一种严重危害规模化养猪场的细菌性传染病，可导致仔猪、保育猪及育肥猪出现多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等症状，对生猪生产造成显著经济损失。兰兽所科研团队针对该病原血清型多、交叉保护性差、耐药性增强及防控产品短缺等行业难题，成功研发出多价灭活疫苗和系列诊断试剂，实现了从技术研发到产品应用的全链条覆盖，为我国养猪业健康发展提供了关键支撑。　　据兰兽研所长郑海学介绍，团队系统研究了我国副猪嗜血杆菌病的流行血清型分布，明确了4、5、12、13型为主要优势血清型，突破了病原分型、抗原鉴定、疫苗株筛选等技术瓶颈，合作创制出覆盖主流血清型的四价蜂胶灭活疫苗，并建立了4种配套病原学与血清学检测方法。该成果已获二类及三类新兽药注册证书各1项，国家发明专利授权2项，软件著作权3项，发表核心期刊论文5篇。此外，团队还牵头制定了我国首个副猪嗜血杆菌检测农业行业标准，成功研发出可替代进口的间接血凝抗体检测试剂盒，实现该诊断产品的国产化。　　兰兽研研究员陈胜利算了一笔账：“以往进口检测试剂盒单价高达100—150元，操作复杂、耗时长。国产试剂盒不仅将成本压缩至12元/头份，检测时间也缩短至2.5小时，更适应现场快速检测的需求。”　　为推动科研成果顺利转化，兰兽研积极与企业合作，构建起了“技术需求—临床研究—市场推广”的一体化链条。家畜疫病病原生物学研究中心常务副主任、成果第一完成人储岳峰表示：“我们以养殖场疫病防控实际需求为导向，实现了生猪疫病的精准检测与免疫，针对匹配血清型菌株感染的仔猪，接种一剂疫苗即可有效防控。”吴涵

引言：顶级期刊《CELL》重磅报道了中国科学家将猪基因重组入新城疫病毒，破解晚期癌症治疗难题，成为兽医技术在人医领域应用的典范，本文章将对报道中的知识点进行解读，大家一起分享这则重大的技术突破。图1：广西医科大学赵永祥团队在《Cell》发表的论文关键词：#新城疫病毒(NDV-GT)；#溶瘤病毒；#肿瘤；#癌症一、技术原理这项研究非常巧妙的提出了一种使用鸡新城疫(NDV-GT)治疗癌症的方法：① 首先将猪的α-1,3半乳糖基转移酶基因（简写GT）重组进新城疫病毒，② 再将该新城疫病毒静脉注射入患者，新城疫病毒会选择性感染癌细胞。因为新城疫病毒是一种溶瘤病毒，被感染的癌细胞会溶解，另外新城疫病毒携带的GT基因在癌细胞细胞膜上表达，而人体内含有丰富的抗半乳糖抗体（GT抗体），从而可以在很短时间内诱发机体的超急性排斥反应，以及体液免疫和细胞免疫，引发免疫效应的级联放大，使肿瘤缩小。该研究在CRISPR编辑的猴子肝癌模型中展示了其疗效，并在晚期肝细胞癌、卵巢癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、黑色素瘤和宫颈癌患者的临床试验中实现了90%的疾病控制率。这种创新的策略解决了当前的障碍，在免疫病毒疗法中通过超急性排斥反应实现基因特异性靶向方面展现出巨大潜力。图2：重组新城疫病毒的构建二、为什么会选择新城疫病毒？1. 新城疫病毒感染肿瘤细胞而不感染正常细胞的原理① 肿瘤细胞常因基因突变导致I型干扰素（IFN）通路缺陷，无法有效抵抗新城疫病毒的入侵和复制。② 肿瘤细胞的DNA损伤修复机制（如ATM依赖的修复通路）常存在缺陷，NDV感染后可通过诱导DNA双链断裂（如通过HN和F蛋白协同作用）进一步加剧肿瘤细胞的死亡，而正常细胞能通过修复机制存活。③ 肿瘤细胞表面某些受体（如EGFR、整合素等）可能高表达，而NDV的囊膜蛋白（如HN蛋白）能优先结合这些受体，促进病毒进入肿瘤细胞。正常细胞此类受体表达水平较低。④ 肿瘤微环境常处于缺氧状态，且肿瘤细胞依赖糖酵解（Warburg效应）提供能量。NDV在缺氧条件下复制效率更高，而正常细胞的氧化磷酸化代谢环境不利于病毒大量复制。⑤ 新城疫感染会触发肿瘤细胞内质网释放大量钙离子（Ca²⁺），导致线粒体钙超载、氧化应激和细胞死亡（如帕特农死亡）。正常细胞的钙稳态调控更完善，能抵抗这种破坏。图3：新城疫病毒的结构和基因组图4：新城疫病毒的溶瘤机制 为什么不选其他溶瘤病毒目前溶瘤病毒(OVs)临床应用的障碍可以从以下四个方面来考虑:① 大多数溶瘤病毒在人体肿瘤细胞内感染和复制的效率不够高。② 在现有携带重组外源基因的溶瘤病毒速分裂和复制过程中，存在外源基因被删除的风险，这可能导致其特性丧失，并有可能恢复到其祖先状态，从而恢复感染和损害正常细胞的能力。③ 溶瘤病毒表达的外源靶蛋白所引发的免疫反应不足以克服免疫抑制屏障。④ 溶瘤病毒具有很强的自抗原性，容易产生高滴度的中和抗体，导致其无法重复使用，且疗效显著降低。因此研究团队选择了新城疫病毒，它能裂解肿瘤细胞且免疫原性较弱，可以反复注射而不用担心中和抗体中和新城疫病毒。三、为什么选择猪的α-1,3半乳糖基转移酶基因（GT）重组进新城疫病毒？GT可合成a-半乳糖苷酶(aGal)表位。异种抗原a-半乳糖苷酶(aGal)可引发超急性排斥反应。如将猪的心脏移植到人体内，会出现超急性排斥，猪心脏被排斥后坏死。人体内天然存在大量抗aGal抗体。人类肠道中的某些细菌（如大肠杆菌、克雷伯菌和沙门氏菌等）的脂多糖（LPS）或其他膜结构上存在α-GAL表位，可作为抗原刺激人体产生天然抗α-GAL抗体。通过肠道菌群的抗原刺激，人体维持了高水平的抗-Gal抗体。新城疫携带的GT基因表达后，人体内的抗-Gal抗体立即结合，引发超急性排斥反应和细胞免疫和体液免疫，使肿瘤细胞坏死、凋亡。图5：新城疫病毒GT裂解肿瘤的分子免疫特征四、该方案治疗肿瘤的效果1.猕猴上验证作者创新性地采用了猕猴的原发性肝癌模型来验证NDV-GT的疗效。研究利用CRISPR.Cas9+技术敲除猕猴肝脏中的Pten和p53基因，快速诱导出与人类肝细胞癌高度相似的原位肿瘤。在该猕猴模型中，NDV.GT经静脉给药后在肿瘤组织中有效增殖并表达a-Gal抗原，引发了局部的超急性排斥免疫反应，导致肿瘤血管内血栓形成和肿瘤细胞坏死，并伴随显著的T淋巴细胞浸润。实验结果证明NDV-GT能够有效抑制猕猴原发肝癌的生长并延长生存期。如下图6所示，K图为肿瘤体积；L为生存率。NDV-GT治疗组（红色）能抑制肿瘤的生长并提高生存率（100%）。图6：猕猴NDV-GT治疗组实验下图7，猕猴原发性肝癌治疗前后3个月的代表性彩色超声图像消失（白色圆圈表示肿瘤病灶）。NDV-GT治疗组肿瘤明显缩小。图7：猕猴原发性肝癌治疗前后彩超2.肿瘤患者临床验证① 一例难治性肝细胞癌伴肺转移患者(A) 治疗前的CT图像显示肝脏内多个大小不等的弥漫性结节（用红色虚线表示）。NDV-GT治疗1.5个月后复查CT，结节大部分消失，仅少部分消失减少的质量保留了下来。(B) 治疗前CT图像显示原发性肝癌双肺广泛转移。经过1.5个月行NDV-GT治疗后，复查CT示肿物明显缩小，多个结节消失。（红色圆圈明显变小，数量也变少了）图8：（A和B）在NDV-GT前和1.5个月后P1的肝脏原发性HCC(A)和肺转移性HCC(B)的计算机断层扫描（CT）图像治疗，肿瘤病灶用红色虚线圈表示。②一例难治性卵巢癌伴转移患者P2期原发性卵巢癌伴腹腔转移术前及术后3个月的正电子发射计算机断层扫描（PET-CT）图像NDV-GT治疗的疗效。肿瘤病灶用白色虚线圈表示。图9：卵巢癌伴转移患者NDV-GT治疗前后共招募了23名难治性癌症患者（下图），其中3人因新冠大流行退出研究，而在剩下20人中，疾病控制率高达90%（18/20），且没有明显不良事件，证实了NDV-GT新型广谱溶瘤病毒疗法对难治性肿瘤的安全性和有效性。图10：NDV-GT能够显著抑制多种晚期癌症患者的肿瘤进展，且未出现严重毒性反应⭐编者语：1. 该方案创造性的将新城疫和GT基因结合，天然溶瘤的同时，诱导超急性排斥反应。由于新城疫病毒的低免疫原性，可以长期重复使用，避免了耐药性。2. 该方案成本低廉。新城疫病毒的培养繁殖条件简单，可通过生物反应器快速增殖，成本低廉，患者不需要承担太高的费用。（如果医院定价太高，就另当别论）3. 样本的数量小，还需要更多数据。临床试验样本量较小，仅有20例可评估患者，属于初步的探索性研究。4. 近些年，癌症、乙肝、系统性红斑狼疮等疾病的研究上都取得了进展，如CAR-NK技术治疗癌症、SCG101V功能性治愈乙肝、 CAR-NK治疗系统性红斑狼疮。如果您正遭受这些疾病的困扰，请保持乐观，积极治疗，现代技术的飞速发展，在不久的将来，这些疾病都可以治愈。引用文献：[1] Lu X, Chen C, Wang Z, Zhang A. Isolation and Characterization of Porcine Epidemic Diarrhea Virus G2c Strains Circulating in China from 2021 to 2024. Vet Sci. 2025 May 6;12(5):444. doi: 10.3390/vetsci12050444. PMID: 40431537; PMCID: PMC12116066.原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/XoC2jkg_e1a9VOF_PGsjiw

近日，中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学研究中心、动物免疫与代谢创新团队在美国微生物学会旗下期刊《mBio》发表了题为“Lumpy skin disease virus LSDV001 protein positively regulates inflammatory response by promoting assembly of the TAK1-TAB2/3 complex”的研究论文。该研究明确了牛结节性皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）编码的LSDV001蛋白是病毒的重要毒力因子，并揭示了其通过诱导过度炎症反应增强病毒致病的分子机制。牛结节性皮肤病是由LSDV引起的一种新发家畜病毒性疾病，已在多个国家造成严重的经济损失，并对兽医公共卫生安全带来挑战。然而，其潜在致病机制尚不清楚，严重制约了有效防控措施的制定。本研究发现LSDV感染能够激活宿主IL-1β和TNFα信号通路，并引发强烈的炎症反应。通过无偏差的NF-ΚΒ荧光素酶报告基因实验筛选，研究团队鉴定到LSDV001蛋白是IL-1β和TNFα炎症信号通路的正调节因子。机制研究表明，LSDV001在感染早期表达，并作为支架蛋白促进TAK1-TAB2/3复合物的组装，增强TRAF2/6与该复合物的相互作用，最终导致TAK1和NF-ΚΒ的过度激活，从而引发过度炎症反应。在牛肾细胞中，与野生型LSDV相比，LSDVD001感染显著减弱了NF-ΚΒ的激活及炎症细胞因子的表达。动物实验结果进一步证实了这一发现：在C57BL/6小鼠中，LSDVD001(LSDV001基因缺失毒株)感染导致的TNFα和IL-6分泌水平明显低于野生型病毒；在叙利亚仓鼠中，LSDVD001感染诱导的炎症反应减弱、皮肤结节减小。该研究成果证实LSDV001是LSDV的重要毒力因子，通过促进炎症反应在病毒致病过程中发挥关键作用。这一发现不仅揭示了LSDV致病的新机制，也为基因缺失疫苗研发提供了重要靶点和理论依据。该论文第一作者为杨钰林副研究员，通讯作者为舒红兵教授和曹立波副研究员。研究工作得到国家重点研发计划、甘肃省科技重大专项等项目资助。相关链接：https://doi.org/10.1128/mbio.01677-25

近日，中国农业科学院兰州兽医研究所动物免疫与代谢创新团队、家畜疫病病原生物学研究中心在国际知名期刊《Journal of the American Chemical Society》发表题为“Targeted Synthesis and Development of Neotype Antiviral Agents with a Radical-Mediated Deoxyphosphoamination Strategy”的研究论文，运用自由基介导脱氧磷酰胺化策略靶向合成并开发了一系列新型抗病毒药物，在探究脱氧转化机理的同时阐明了合成化合物N-(2-(二苯基磷酰基)-1H-茚-3-基)-P,P-二苯基次膦酰胺(IDPA)抗PRRSV的具体机制，为抗病毒药物设计提供了新思路和新工具，也展示了自由基化学在药物开发中的应用潜力。病毒感染的持续威胁对全球公共卫生和畜牧业经济构成严峻挑战。猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)、猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、H1N1猪流感病毒 (H1N1)等病原体不仅造成巨大经济损失，还可能导致人畜共患病风险。传统抗病毒药物开发面临病毒突变、耐药性以及现有候选化合物化学多样性有限等瓶颈问题。该团队在前期筛选中，发现N-(2-(二苯基磷酰基)-1H-茚-3-基)-P,P-二苯基次膦酰胺 (IDPA) 具有潜在抗病毒活性，但传统合成方法步骤繁琐、效率低下，严重制约了结构优化和生物活性研究。含氧化合物的脱氧功能化为解决这一挑战提供了新思路，但现有方法通常依赖金属催化剂或昂贵试剂，在生物体系中的应用受到限制。抗病毒化合物的筛选与酮类化合物的脱氧磷酰胺化图该研究首先开发了无金属、无光、无电条件下的自由基介导脱氧磷酰胺化反应，直接从酮类出发构建IDPA及其类似物。其次，通过细胞实验检测了这些类似物的抗PRRSV效果建立结构-活性关系，同时解析了IDPA抗PRRSV的具体机制：通过下调病毒受体蛋白CD163和宿主蛋白HSP70抑制PRRSV复制。最后，评价了这些化合物的细胞安全性，发现其对PRRSV、CSFV、PCV2、PEDV、H1N1等病毒具有良好的广谱抗病毒效果。这一研究不仅开发了一种新的脱氧转化方法学，而且合成了一系列廉价高效的广谱抗病毒先导化合物，建立了"化学合成-生物评价-机制解析"三位一体的抗病毒药物研发技术体系，为突破传统抗病毒药物研发瓶颈提供创新性解决方案。肖书奇教授为本文通讯作者，张建武博士为第一作者，刘霄博士为共同第一作者。该研究得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、甘肃省联合基金、甘肃省重大科技专项、中国农业科学院基础研究中心创新项目、动物疾病防控国家重点实验室、国家生猪技术创新中心项目等项目的资助。文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c10745

非洲猪瘟（ASF）是一种对家猪、野猪和疣猪等具有高度传染性和致死性的出血性疾病，给全球养猪业带来巨大的经济损失，目前尚缺少安全且有效的疫苗，同时对于候选ASF疫苗安全性和有效评价缺乏统一的方法和标准攻毒毒株。2025年9月3日，中国科学院微生物研究所&中国兽医药品监察所国家/WOAH猪瘟参考实验室&中国农业大学动物医学院等研究人员在Journal of Virology上发表题为“An attenuated African swine fever virus with deletions of the CD2v and A137R genes offers complete protection against homologous challenge in pigs”的研究论文。该研究以ASFV基因型II毒株 HuB/HH/2019为骨架，利用CRISPR技术对ASFV毒力基因CD2v、A137R进行敲除，构建了基因缺失减毒毒株HuBΔCD2vΔA137R。研究人员将该减毒毒株作为靶疫苗，进行了免疫攻毒保护试验验证，建立了一套体内、体外多层次的ASF候选疫苗安全性和有效性评价范式和方法。研究人员将HuBΔCD2vΔA137R毒株以105 TCID50剂量肌肉注射接种仔猪，对动物的症状、病毒血症和排毒带毒情况，以及特异性抗体、细胞因子、外周血淋巴细胞（PBMC）RNA转录组测序等可以反应体液免疫和细胞免疫水平等指标进行27天监测。用亲本毒株HuB/HH/2019以102 HAD50剂量肌肉注射攻毒，攻毒后22天内监测动物的症状、病毒血症和排毒、带毒以及剖检组织中的病毒载量。结果显示，所有接种HuBΔCD2vΔA137R的仔猪在观察期内均未表现出明显的高热（>40.5℃）和严重的ASF症状，仅出现轻度病毒血症，并在接种24天后清除，同时，诱导产生了高水平ASFV抗体。免疫仔猪攻毒后均全部存活，且在22天监测期内，未出现任何发热或症状。与此相反，对照组仔猪攻毒后11天内表现出明显ASF症状并全部死亡。对接种动物细胞因子、外周血淋巴细胞RNA转录组测序分析结果显示，基因缺失减毒毒株可以激发机体产生先天和被动免疫反应。中国科学院微生物研究所高福院士、中国兽医药品监察所国家/WOAH猪瘟参考实验室刘业兵研究员为共同通讯作者。中国农业大学、中国科学院微生物研究所联合培养博士、中国兽医药品监察所国家/WOAH猪瘟参考实验室副研究员彭国瑞，中国科学院微生物研究所研究员赵欣，中国兽医药品监察所国家/WOAH猪瘟参考实验室研究员邹兴启为论文共同第一作者。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目资助。相关研究数据上传至中国国家微生物、基因组科学数据平台。原文链接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/jvi.00262-25图1 动物免疫接种与攻毒试验时间轴图2 ASFV HuB△CD2v△A137R的免疫攻毒试验结果

由猪瘟病毒（CSFV）引起的猪瘟（CSF）对全球养猪业仍具有重大威胁。本研究设计并评估了3种脂质纳米颗粒（LNP）包裹的mRNA疫苗候选物，分别编码E2糖蛋白胞外结构域（E2_EX）、E2_EX与猪流行性腹泻病毒（PEDV）S蛋白跨膜（TM）区融合（E2tm）以及E2_EX与流感病毒血凝素（HA）蛋白TM区融合（E2tm-HA）。其中，E2tm mRNA疫苗在猪体内诱导了最强烈的抗体反应。仔猪接种E2tm mRNA疫苗后，发现其免疫原性未受母源抗体的影响。对假尿嘧啶核苷（Ψ）修饰（ΨE2tm）和未修饰（E2tm）mRNA疫苗的比较分析显示，E2tm诱导的抗体滴度显著高于ΨE2tm。所有接种疫苗的猪在CSFV攻击下均存活，其中150微克E2tm剂量提供了最佳保护，有效抑制了病毒血症并防止病毒扩散到组织中，同时拭子样本中的病毒RNA检测结果为阴性。研究获得的新型mRNA疫苗，可作为抗CSFV感染的替代接种策略。文章结果基于E2糖蛋白的氨基酸序列，研究设计了三种mRNA构建体：E2_EX缺乏E2糖蛋白的跨膜区；E2tm包含来自猪流行性腹泻病毒（PEDV）S2蛋白的替代跨膜区；E2tm-HA则融合了流感病毒血凝素（HA）蛋白的跨膜区。先前的研究表明，天然E2跨膜区因其高度疏水性而抑制蛋白质表达。在本研究中，跨膜区被已知可表达的S2或HA的跨膜区所替代。为了提高蛋白质表达效率，还在mRNA序列的N端添加了先前报道的天然E2信号肽。经过脂质纳米颗粒（LNP）封装后，成功制备了三种mRNA疫苗候选物，并在人胚肾293T（HEK293T）细胞中表达。我们的研究结果证实，S2和HA蛋白的跨膜区可用于E2的蛋白质表达，这主要归因于其跨膜区的疏水性。此外，测试了三种mRNA疫苗在猪体内的免疫原性。与E2_EX和E2tm-HA mRNA疫苗、E2亚基疫苗以及C株疫苗相比，E2tm mRNA疫苗诱导产生了最高水平的猪瘟病毒（CSFV）特异性抗体和中和抗体。值得注意的是，E2tm mRNA疫苗诱导产生的抗体不受母源抗体的影响。这些数据表明，S2蛋白的跨膜区对E2免疫原性具有最佳支持作用。mRNA疫苗的效力会受到核苷酸修饰的影响，如假尿嘧啶核苷（Ψ），它通过抑制Toll样受体（TLR）信号传导和蛋白激酶R（PRK）激活来提高mRNA的翻译效率。然而，有证据表明，未经修饰的密码子优化mRNA可能实现更高的蛋白质表达（48）。为了评估这一点，我们制备了Ψ修饰的E2tm（ΨE2tm）mRNA疫苗（图4A和B），并比较了Ψ修饰（ΨE2tm）和未修饰的E2tm mRNA疫苗。结论综上所述，本研究成功开发了三种表达猪瘟病毒（CSFV）E2糖蛋白的mRNA疫苗，其中E2tm mRNA疫苗表现出更强的免疫原性。进一步研究表明，Ψ修饰和未修饰的E2tm mRNA疫苗均能诱导持久的抗体反应和细胞免疫，为抵御CSFV攻击提供了有效保护。特别是150微克剂量的E2tm疫苗表现出最佳的免疫反应和保护效果。因此，我们提出了一种CSFV mRNA疫苗候选物，该候选物可进一步优化，并可作为预防CSFV感染的替代性CSFV疫苗。（来源：Journal of Virology）