作者 

胡恒睿、柯喜泉、肖寒、商献菲、尹琪然、李江、李祥敏、胡志红、钱平、王曼丽

单位

^a中国科学院武汉病毒研究所，高致病性病毒与生物安全全国重点实验室

^b华中农业大学，湖北洪山实验室，农业微生物全国重点实验室

^c华中农业大学动物医学院

^d湖北江夏实验室

摘要 

随着合成生物学技术的飞速发展，几种大型DNA病毒的基因组已被从头合成并组装，实现了相应病毒的功能性拯救。伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）是一种疱疹病毒科的大型DNA病毒，可引起猪的严重疾病，给全球养猪业造成重大经济损失。基因组编辑技术可用于减弱PRV毒力和开发更安全的疫苗。然而，伪狂犬病病毒复杂的重复序列和极高GC含量的基因组给遗传操作带来了巨大挑战。在本研究中，研究团队开发了一种基于酵母转化相关重组（TAR）技术的PRV基因组组装平台。将流行基因II型变异株PRV-GX-2011的基因组（GenBank编号：PV405324.1）分成9个A级片段，并通过TAR技术克隆到载体中。随后，通过每3个A级片段重组产生3个B级片段。在此基础上，利用体外CRISPR/Cas9介导的编辑技术，将egfp基因插入UL23与UL22基因间的非编码间隔区。通过将线性化的B级片段共转染至Vero细胞，成功拯救出具有感染性的病毒，并通过噬斑试验纯化出一株病毒，命名为PRV-GX-Syn1。尽管PRV-GX-Syn1的病毒滴度和噬斑大小均低于亲本株，但其形态特征与亲本病毒无明显区别。在BALB/c小鼠中，PRV-GX-Syn1可引起致死性感染，其肺部病理变化与亲本株相当。该基于TAR的平台为PRV基因组提供了更快速、更灵活的修饰手段，有助于基础研究和以PRV为载体的疫苗开发。

Fig. 1.  Schematic flowchart of genome assembly and virus rescue.

Fig. 2.  Biological characteristics of rescued virus.
Fig. 3.  Growth characteristics and morphogenesis of PRV-GX-Syn1. 

Fig. 4.  Characterization of the rescued PRV-GX-Syn0 and comparison with the parental strain PRV-GX-2011.

Fig. 5.  In vivo pathogenicity comparison of PRV-GX-Syn1 and PRV-GX-2011. 

本文亮点

• 利用转化相关重组（TAR）技术，成功开发了一套精准高效的伪狂犬病病毒（PRV）基因组组装平台
• 通过体外 CRISPR/Cas9 技术，将egfp 基因精准插入UL23 与 UL22 基因间的非编码区
• 通过亚基因组片段共转染，成功拯救出具有感染性的重组病毒，命名为 PRV-GX-Syn1
• 拯救获得的 PRV-GX-Syn1 病毒，其在细胞及小鼠模型中的生物学特性与亲本株基本一致。