禽流感病毒（AIV）因其传染性以及对家禽、鸟类和人类健康的破坏性影响而持续引发关注。禽流感病毒的基因组包含8个基因片段：血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白（M）、核蛋白（NP）、非结构蛋白（NS）、酸性聚合酶（PA）、碱性聚合酶1（PB1）和碱性聚合酶2（PB2）。流感病毒根据其HA和NA蛋白的抗原性分为不同亚型。目前，在禽类中已鉴定出16种HA 亚型和9种NA亚型。高致病性禽流感病毒（HPAIV）是一种以鸟类为主要宿主的病毒，具有高发病率和死亡率，可导致家禽和人类死亡。此外，低致病性禽流感病毒（LPAIV）毒株感染后不会直接影响家禽和健康人类，但家禽感染后若未得到控制且持续存在，也会产生不良后果。更令人担忧的是，低致病性禽流感病毒可能会将内部基因水平转移给高致病性禽流感病毒，从而增强其毒力和致病性 。

大规模疫苗接种是控制禽流感疫情和减轻禽流感病毒引起的严重症状的最有效方法之一。由于禽流感疫情的复杂性，中国严格执行扑杀和生物安全措施，同时将大规模家禽疫苗接种作为快速缓解严峻形势的合理替代策略。中国政府为家禽养殖户免费提供禽流感病毒疫苗。在中国实施的大规模疫苗接种策略取得了巨大进展。2006-2013年在中国北方散养家禽中广泛流行的 H5 分支7.2，自2014年使用相应疫苗后已基本消除，且未再被检测到。

尽管大规模疫苗接种策略成效显著，但免疫逃逸仍时有发生，因此禽流感疫情尚未得到完全控制。科学家们担心，在免疫压力下，高抗体水平会加速病毒突变和多样化，从长远来看会导致疫情形势更加复杂。HA 蛋白在病毒结合宿主细胞表面受体方面起着关键作用，从而介导宿主细胞与病毒膜的融合。然而，抗HA 的抗体通过干扰病毒与受体的结合来阻断这一过程，进而阻断下游过程。NA 蛋白可防止流感病毒颗粒在细胞表面积累，并参与病毒释放，从而促进进一步感染。HA和NA蛋白均具有免疫原性，可在受感染动物中诱导体液免疫应答。这些蛋白在不同病毒之间差异最大，是抗原漂移（即氨基酸变化逐渐积累，最终降低抗体识别能力并导致免疫逃逸）的重要原因 。因此，研究工作集中在改进疫苗和开发新的疫苗平台，以实现对潜在大流行性禽流感病毒的有效保护。

开发一种能完全预防禽流感病毒感染的高效疫苗是一项具有挑战性的任务。理想的禽流感疫苗应满足以下要求：生产成本低且可大规模应用、适用于多种禽类、能区分感染禽和免疫禽、与流行病毒株抗原性接近、单剂接种可提供持久保护、在母源抗体存在时能诱导保护性免疫应答。尽管已开发出多种形式的疫苗来预防流感病毒，包括传统疫苗和新型疫苗（图1），但目前没有一种疫苗能满足所有这些标准。下面是对传统和下一代平台的各类禽流感疫苗进行的评估。

图 1. 传统流感疫苗与下一代流感疫苗的优缺点。流感病毒疫苗的研发基于完整病毒颗粒、表面蛋白、核蛋白、病毒基因组以及减毒病毒等策略。

1. 灭活疫苗

中国最广泛使用的AIV疫苗形式，采用鸡胚培养技术生产。为克服鸡胚传代导致的抗原变异，可采用MDCK或Vero细胞系培养病毒。β-丙内酯灭活能更好保持病毒抗原结构，相比甲醛灭活可诱导更强的CD8+ T细胞应答。中国已通过反向遗传学技术开发了系列H5亚型灭活疫苗种毒（表1），如针对2.3.4.4b分支的Re-14株等。

注：HA 代表血凝素。缩写：GS—— 鹅；CK—— 鸡；DK—— 鸭；WS—— 大天鹅；GD—— 广东；SX—— 山西；AH—— 安徽；LN—— 辽宁；GZ—— 贵州；FJ—— 福建。

2. 活疫苗

包括减毒活疫苗和病毒载体疫苗。美国等国家使用冷适应减毒活疫苗，通过鼻腔接种诱导黏膜IgA和系统IgG应答。中国家禽业主要采用：禽痘病毒载体疫苗：可提供异源H7病毒交叉保护；新城疫病毒载体疫苗：已在中国使用40亿剂次；火鸡疱疹病毒载体：克服母源抗体干扰，提供持久免疫。

3. 病毒样颗粒（VLP）疫苗

病毒样颗粒（VLP）疫苗作为禽流感病毒疫苗开发的潜在候选者备受关注 。病毒样颗粒是自组装的非感染性颗粒，表明这些疫苗具有较高的安全性。这些颗粒可通过细菌、酵母、昆虫和动物细胞系等不同表达系统生产，由于其免疫原性特征，可用作疫苗开发中的颗粒载体或抗原。此外，它们具有与原始病原体相当的特征，例如相似的大小、重复的表面几何结构，以及刺激抗原呈递细胞（APCs）（特别是树突状细胞（DCs））以及诱导体液和细胞免疫应答的能力。因此，宿主的免疫系统可以以与完整的灭活病毒疫苗相同的方式识别病毒样颗粒疫苗，从而产生强烈的免疫应答。

基于病毒样颗粒疫苗已广泛用于流感疫苗的开发，并在提供免疫保护方面取得了令人鼓舞的成果。研究表明，由三种流感病毒蛋白（包括 HA、NA 和基质蛋白 1（M1））组成的 H5N1、H3N2 和 H9N2 病毒样颗粒疫苗可在昆虫细胞中表达并组装成病毒样颗粒。Hu等人使用杆状病毒表达系统构建了一种二价 H5+H7 病毒样颗粒疫苗，该系统可表达HA、NA和M1蛋白。二价病毒样颗粒疫苗和商业灭活疫苗均诱导了有效的免疫应答，包括产生抑制血凝、中和病毒和靶向HA的抗体。与商业灭活疫苗相比，二价病毒样颗粒疫苗在减少鸡的病毒脱落和复制方面效果显著。此外，二价病毒样颗粒疫苗在减少H7N9 病毒感染引起的鸡肺部病变方面优于商业疫苗。

4. 通用疫苗

禽流感病毒的HA和NA蛋白突变率高，因此疫苗的种子病毒也需要相应改变以匹配流行的流感病毒。因此，开发一种能诱导长期免疫应答并提供针对多种不同病毒株保护的通用流感疫苗至关重要。通用疫苗的开发工作主要依赖于保守的保护性表位。有前景的通用疫苗候选者包括细胞外基质蛋白2（M2e）、HA茎部、HA的受体结合位点（RBS）以及M1和核蛋白（NP）中的一些细胞毒性 T淋巴细胞（CTL）表位。

5. DNA疫苗

典型的 DNA 疫苗是将编码抗原的基因插入非复制型真核表达质粒载体中，通过直接基因转移递送至宿主。然后，宿主细胞表达质粒编码的抗原蛋白，并通过主要组织相容性复合体（MHC）途径呈递给免疫细胞。DNA疫苗诱导的免疫应答是Th1型免疫应答，其中针对DNA疫苗的细胞介导的免疫比体液免疫更普遍 。先前的一项研究表明，DNA疫苗的作用机制模拟了病毒的细胞发病机制 。抗原蛋白在细胞内被蛋白酶体消化成更小的肽段。这些肽段随后由MHC I类分子呈递，以诱导抗原特异性CD8+T细胞应答。此外，这些肽段也由MHC II类分子呈递，以激活 CD4+T 辅助细胞，进而触发活化的B细胞产生抗原特异性抗体。

早期研究表明，编码HA基因的DNA疫苗可根据HA特异性血清抗体水平的升高来保护家禽免受致命的同源攻击。要有效抵抗鸡中高致病性禽流感病毒的攻击，DNA疫苗的质粒DNA剂量约需200-400μg。这种高剂量免疫要求是此类疫苗在田间应用的主要障碍。另一方面，抗原在宿主中的有效表达是DNA疫苗的关键。基于宿主物种的密码子偏好性，可以调节抗原编码序列以提高表达效率。这种策略可通过提高抗原基因的表达来减少DNA疫苗的剂量。接种密码子优化的HA质粒的动物比接种野生型HA质粒的动物抗体滴度高4倍，从而在病毒攻击试验中具有更高的存活率。

6. mRNA疫苗

目前，mRNA疫苗可分为两大类：常规的非扩增mRNA分子和源自RNA病毒载体、具有自主复制活性的自扩增mRNA（saRNA）。非复制型mRNA疫苗可通过掺入各种修饰的核苷来生产。saRNA疫苗可以多种形式递送，包括病毒样RNA颗粒、质粒DNA和体外转录的RNA。

7. DNA疫苗的递送策略

近十年来，DNA疫苗的递送策略一直是研究的热点领域。有效的DNA疫苗需要能够进入宿主细胞并实现蛋白质表达，此外，这种疫苗还必须能够提醒免疫系统其存在并诱导免疫应答。有文献指出，接种裸DNA疫苗后，质粒DNA会迅速从注射部位迁移并降解，因此在小鼠中，8小时后仅能偶尔检测到质粒DNA。研究人员一致认为，将DNA直接递送至抗原呈递细胞提供了一种潜在的疫苗递送系统。然而，将质粒DNA疫苗有效递送至细胞核需要跨越多个障碍，包括通过内吞作用或胞饮作用穿过磷脂细胞膜、在内涵体和溶酶体中应对降解、在胞质核酸酶中存活、跨核膜转运，以及最终实现抗原蛋白表达。因此，DNA疫苗递送系统的关键点在于克服这些生物障碍，靶向免疫细胞，并将质粒安全递送至细胞的细胞核以进行蛋白质表达。已尝试多种策略来提高DNA疫苗的递送效率，包括聚合物、脂质体、活细菌等。此外，在新冠肺炎疫苗开发之后，脂质纳米颗粒（LNPs）的疫苗潜力在 DNA 疫苗递送方面受到关注。此外，基因枪作为一种机械递送装置，可将大分子导入靶细胞，也已用于DNA疫苗递送。

7.1. 聚合物递送系统

聚合物已广泛用作组织工程、基因治疗和DNA疫苗接种等应用中的递送系统。聚合物可将DNA材料包装成纳米颗粒和微米颗粒，以防止核酸酶的破坏，并允许可调节的降解和控制释放。此外，这种颗粒结构易于被免疫细胞捕获。如今，多种聚合物已被探索用于DNA疫苗开发（图2）。

图 2. 基于聚合物的 DNA 疫苗递送设计。聚合物可由来源于生物体的单体单元或人工合成的单体单元制成，包括壳聚糖、聚乳酸 - 乙醇酸共聚物（PLGA）、聚乙烯亚胺（PEI）、多肽以及其他非离子嵌段共聚物。聚合物可通过络合或包封作用保护 DNA 免受降解，并将其递送至宿主细胞以诱导免疫应答。

聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）已被用于包装和递送针对多种动物疾病的 DNA疫苗，如流感、口蹄疫病毒（FMDV）和寄生虫感染。将DNA疫苗包装到聚乳酸-乙醇酸共聚物中可增强全身性、抗原特异性抗体和T细胞增殖应答。此外，据报道，DNA包被的聚乳酸-乙醇酸共聚物微颗粒可增强DNA疫苗向抗原呈递细胞的递送。然而，尽管使用聚乳酸-乙醇酸共聚物递送DNA已被发现可诱导免疫应答，但仍存在一些问题，包括在包封过程中DNA降解以及由于微米尺寸导致的转基因表达较低。因此，研究人员开发了一种使用乙二醇壳聚糖外壳的改良聚乳酸-乙醇酸共聚物纳米颗粒，用于双活细胞追踪和DNA疫苗递送。这些颗粒可直接转染朗格汉斯细胞，增强基因转录和表达。因此，聚乳酸-乙醇酸共聚物纳米颗粒促进DNA迁移至淋巴结以及初始B细胞和T细胞的活化。

聚乙烯亚胺（PEI）是另一种广泛用于DNA疫苗递送的聚合物。聚乙烯亚胺在DNA疫苗递送中的应用已得到充分研究，并有报道称可改善H1N1 DNA疫苗的体液应答。然而，DNA / 聚乙烯亚胺复合物存在毒性问题、在血清蛋白存在下聚集以及从循环中快速清除等问题，导致DNA递送效率有限。为克服这些问题，使用γ- 聚谷氨酸修饰DNA / 聚乙烯亚胺复合物，通过降低复合物的表面电荷，减少聚集并提高在生理环境中的稳定性。γ- 聚谷氨酸由某些杆菌菌株产生，据推测可通过与免疫细胞的受体相互作用充当佐剂。

一些天然材料也被研究用于其他生物应用，包括基因递送，因为它们具有固有的生物相容性、无毒性、生物降解性、稳定性、生产成本低和免疫刺激等特性。例如，菊粉、透明质酸、藻酸盐以及壳聚糖在疫苗递送领域引起了关注。壳聚糖是来自甲壳的几丁质的部分脱乙酰化形式，已被充分研究用于DNA疫苗递送。壳聚糖必须在弱酸性环境（pH<5）中溶解；这种特性使其适合化学修饰，从而改变溶解度和电荷，使其适用于各种应用。此外，壳聚糖已被确定为一种无毒且生物相容性材料，因此其使用已获得美国食品药品监督管理局的批准。固定在壳聚糖包被的微球（20至50μm）中的质粒DNA可诱导黏膜和全身性免疫应答。

7.2. 脂质体递送系统

20 世纪 60 年代，脂质体首次被发现并用于提供研究生物膜的模型。所有脂质体都有一个共同特征，即它们是头部带有阳离子基团的两亲分子。经过持续研究，脂质体的优点是负载能力高、生物降解性好、安全性更高，以及生产相对简单且成本低 。此外，脂质体可根据模块化原则进行设计，因此可修饰结构、连接体和亲脂区域以获得更高的递送效率。脂质体主要有四种类型，包括常规脂质体、聚乙二醇修饰的脂质体（PEG化）、配体靶向脂质体和抗体修饰的脂质体（图3）。

图 3. 不同类型脂质体递送系统的示意图。（A）传统脂质体：脂质体由脂质 bilayer 组成，可由带正电、带负电或中性的脂质构成，其中包裹着水核。（B）聚乙二醇化脂质体：脂质体表面可通过添加聚乙二醇进行修饰，以实现空间稳定。（C）配体靶向脂质体：脂质体表面可通过添加配体进行修饰，以实现特异性靶向递送。（D）抗体修饰脂质体：抗体（单克隆抗体、纳米抗体、Fab 片段和单链抗体片段）可附着在脂质体表面。

常规脂质体是第一代脂质体，由阳离子、阴离子或中性脂质组成的脂质双层构成。为增强脂质体稳定性并延长其在生物体内的循环时间，通过聚乙二醇修饰引入了空间稳定的脂质体。此外，配体靶向脂质体在将DNA疫苗定点递送至特定细胞类型（尤其是选择性表达或过表达特定表面配体的抗原呈递细胞）方面具有相当大的潜力。有多种类型的配体可用，包括肽、蛋白质和小分子。抗体，特别是单克隆抗体（mAb）、纳米抗体以及可固定在脂质体表面的抗体的抗原结合区，是用途更广的配体之一。脂质体形成球形囊泡，其结构由磷脂和胆固醇排列成脂质双层，允许与细胞膜融合。质粒DNA可隔离在脂质体双层上或包裹在脂质体囊泡内。脂质体作为DNA疫苗递送载体的应用引起了极大关注，因为它们能够产生尺寸可控的实体、允许载体定制，并能引发先天免疫受体的活化。脂质体能够产生亚微米级颗粒，有助于掺入大量DNA，从而防止DNA因阴离子竞争而置换。这一特性确保大量 DNA 被有效包裹在脂质双层中。

在疫苗制剂中，脂质体能够调节组织中的局部分布、增强在注射部位的保留，并调节细胞运输。用脂质体制备的疫苗具有多种优势，包括促进抗体产生增强和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答。然而，需要注意的是，脂质体引发的免疫应答的具体特征因脂质组成、颗粒大小、表面电荷和包裹抗原的位置等因素而异。

7.3. 活细菌递送系统

用于DNA疫苗递送系统的细菌是经过基因修饰的重组细菌，确保其大部分致病性成分已被删除，从而保证宿主的安全。作为DNA疫苗递送系统，细菌分为两大类：非致病性细菌和减毒的致病性细菌。已研究用于DNA递送的减毒细菌包括单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属和小肠结肠炎耶尔森氏菌。致病性细菌以黏膜作为其感染途径，因此适合黏膜给药。然而，主要缺点是可能引起感染。因此，非致病性细菌如乳酸菌可能更适合开发为DNA疫苗递送系统。

乳酸菌是用于DNA疫苗递送工程改造的优良候选者。自古以来，它们就被用于食品发酵，并且通常被认为是安全的生物体。几种乳酸菌菌株被认为是益生菌，可通过抑制病原体在胃肠道中的定植来增强对病原体的免疫应答，并促进黏膜免疫系统 。

图 4. 利用活菌将 DNA 疫苗递送到哺乳动物细胞中的拟议机制示意图。（A）侵入宿主后，细菌会被多种细胞识别，包括微皱褶细胞、上皮细胞或免疫细胞。（B）重组细菌被吞噬溶酶体复合体内化，随后发生裂解。在此过程中，DNA 疫苗从囊泡中释放出来并转运到细胞核中，从而使抗原基因得以转录。产生的抗原蛋白被呈递给免疫系统，引发细胞免疫和体液免疫应答。

7.4. 树突状细胞靶向增强疫苗免疫效率

B淋巴细胞和T淋巴细胞通过抗原呈递细胞的作用启动适应性免疫应答，抗原呈递细胞从内环境中捕获抗原并将其呈递给这些淋巴细胞。抗原呈递细胞是一组异质细胞，包括巨噬细胞、B细胞、髓系树突状细胞亚群和浆细胞样树突状细胞（pDCs）。鉴于抗原呈递细胞在触发免疫应答中的关键作用，已探索多种策略将抗原特异性靶向一种或多种抗原呈递细胞亚群。在这些不同细胞类型中，树突状细胞因其高效的抗原摄取、加工和随后向T细胞的呈递而被认为具有特别重要的意义。暴露于靶向材料会导致树突状细胞成熟并迁移至淋巴结，从而产生免疫应答。同时，树突状细胞靶向材料还可通过产生保护性细胞因子（如 IL-2、IL-4 和 IFN-Ⅰ）发挥作用，这些细胞因子影响适应性免疫应答的不同步骤和先天淋巴细胞的活化。因此，将抗原递送靶向树突状细胞是一种更直接、更省力的诱导有效免疫应答的策略，近年来引起了广泛关注。

先天免疫系统的细胞表达模式识别受体（PRRs），由于其在适应性免疫发展之前出现，也称为病原体识别受体或祖先模式识别受体。模式识别受体主要分为两类。第一类是内吞模式识别受体，可特异性结合碳水化合物。这类受体包括甘露糖受体（MR）、葡聚糖受体和清道夫受体（SR）。第二类是信号模式识别受体，包括膜结合的Toll样受体（TLRs）和细胞质NOD样受体。树突状细胞表面已鉴定出多种模式识别受体，包括 DC-SIGN、甘露糖受体、Toll样受体、清道夫受体和 DEC-205。其中，C型凝集素形成一个多样化的凝集素家族，其特征是具有碳水化合物识别结构域。在树突状细胞中，关键的C型凝集素如 DC-SIGN、DC-SIGNR、DCAR、DCIR、Dectins和DLEC在细胞运输、免疫突触形成以及细胞和体液免疫应答启动等过程中起着至关重要的作用。Toll样受体是先天免疫受体，可通过配体的模式识别处理来检测多种分子，包括组织损伤信号、细菌、病毒、原生动物和线虫。已鉴定出 13 种已知的Toll样受体，它们可识别多种微生物抗原，但在对微生物模式的特异性方面有所不同。靶向这些受体正成为在树突状细胞靶向疫苗中递送抗原的有效方法。

树突状细胞靶向策略正处于抗病毒病原体和癌症疫苗开发的研究阶段（图 5）。抗原被设计成附着于已鉴定的可与树突状细胞结合的分子。当这些携带抗原的分子被注射到体内并被树突状细胞摄取后，树突状细胞会激活免疫系统产生应答。

图 5. DNA 疫苗的树突状细胞靶向递送策略介绍。步骤 1：DNA 疫苗由一个质粒组成，该质粒在哺乳动物启动子的作用下编码抗原基因。步骤 2：用表面修饰了树突状细胞（DC）靶向配体的包装材料对其进行包封。步骤 3：将 DNA 递送疫苗复合物靶向到树突状细胞后，编码的抗原在树突状细胞内表达，并通过主要组织相容性复合体（MHC）途径呈递处理后的抗原，以激活初始 T 细胞。步骤 4：树突状细胞通过 MHCⅡ 类途径触发 CD4⁺辅助性 T 细胞的激活，B 细胞通过识别分泌的抗原或被激活的 CD4⁺辅助性 T 细胞而被激活，从而产生不同类型的抗体。步骤 5：内源性表达的抗原通过 MHCⅠ 类分子呈递，主要激活 CD8⁺T 细胞免疫。释放的细胞因子（γ 干扰素 [IFN-γ] 或肿瘤坏死因子 -α[TNF-α]）可抑制病毒复制并增强 MHCⅡ 类分子的表达。同时，巨噬细胞也被激活，以支持细胞介导的免疫应答。

8. 结论

总之，大规模疫苗接种仍是控制家禽中禽流感病毒感染和传播的多管齐下策略的重要组成部分。禽流感病毒大流行的持续威胁凸显了开发新型疫苗的必要性，与现有禽流感病毒疫苗相比，新型疫苗应具有更简化、更易于制造的工艺，并能有效免疫保护以应对潜在的大流行毒株。尽管在开发和设计多种抗大流行威胁的禽流感病毒疫苗方面取得了最新进展，但开发理想的禽流感病毒疫苗仍有几个方面值得关注。高效佐剂的开发是禽流感病毒疫苗研究的一个重点领域。目前正在开发能更有效地刺激免疫系统同时将副作用降至最低的新型佐剂，这可能会提高疫苗的效力和安全性。此外，不应忽视改变免疫途径，因为已表明皮内注射在产生免疫应答方面更有效，且可能需要更小剂量的疫苗，从而可能提高疫苗的可获得性。总体而言，本综述中提出的多种策略有助于更好地理解当前的禽流感病毒疫苗。随着研究人员继续探索创新方法来开发更有效、更易获得的疫苗，疫苗开发的未来前景广阔。

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