摘要：为了解我国新出现的禽副黏病毒14型（APMV-14）的基因组特性，对2022年从我国家禽中新分离到的2株APMV-14毒株进行了基因组测序和序列分析。结果显示：两株毒株基因组长度均为15 444 nt，结构均为3'-N-P-M-F-HN-L-5'，3'前导序列和5'尾随序列长度分别为55和277 nt，各基因间隔序列长度不等（2~36 nt）；2株毒株F蛋白裂解位点均为99REGR↓L103，具有低致病性禽副黏病毒分子特征；2株毒株HN蛋白长度均为607 aa，明显长于2011年日本分离株APMV14/duck/Japan/11OG0352/2011（580 aa）。同源性分析显示，我国分离的2株不同宿主来源的APMV-14毒株基因组核苷酸同源性为99.5%，与APMV-14代表株11OG0352同源性最高（91.0%），与其余禽副黏病毒同源性仅为45.0%~52.3%；遗传进化分析显示，2株APMV-14毒株与日本APMV-14分离株（11OG0352）位于同一分支。综上所述，本研究中的2株来源于不同宿主（鸡和鸭）的APMV-14毒株基因组序列高度同源，说明APMV-14已具备水禽—陆禽的跨种传播能力。本研究为APMV-14生物学特性等相关研究奠定了基础。禽副黏病毒（Avian Paramyxovirus，APMV）在分类地位上属于副黏病毒科禽腮腺炎病毒亚科，主要包括3个病毒属，即正禽腮腺炎病毒属、副禽腮腺炎病毒属和偏禽腮腺炎病毒属。目前已鉴定的APMV至少包括21种血清型，分别为APMV-1~21。其中，APMV-1、APMV-9、APMV-12、APMV-13、APMV-16~19和APMV-21属于正禽腮腺炎病毒属，APMV-2、APMV-5~8、APMV-10、APMV-11、APMV-14、APMV-15和APMV-20属于偏禽腮腺炎病毒属，APMV-3和APMV-4属于副禽腮腺炎病毒属。APMV是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，基因组长为1.3万~1.7万核苷酸（nucleotide，nt），可感染多种野鸟和家禽。APMV-1~9出现于20世纪80年代前，2005—2015年又在多种野鸟和企鹅中陆续分离到APMV-10~21，其中2011年在日本野鸭中首次分离到APMV-14，至2021年未见有关分离到APMV-14毒株的其他报道。目前，我国流行的APMV主要为APMV-1，即新城疫病毒。近年来，在我国家禽和野鸟中也分离到APMV-2、APMV-4和APMV-6等毒株。2022年，在我国福建省鸡群和江西省鸭群中各分离到1株APMV-14。为了解我国家禽中APMV-14分离株的基因组特性，本研究对2株APMV-14分离株进行了基因组测序和序列分析，以期为APMV-14生物学特性等相关研究奠定基础。chicken/Fujian/1013/2022（FJ1013）和duck/Jiangxi/1232/2022（JX1232），均在新城疫监测中被分离到，分别分离自福建省和江西省活禽市场采集的临床健康家禽口咽/泄殖腔拭子样品，由中国动物卫生与流行学中心禽病监测室保存。将病毒液经尿囊腔接种9~11日龄SPF鸡胚（购自山东济南斯帕法斯家禽有限公司），0.2 mL/枚，每个样品接种5枚鸡胚；接种后37 ℃条件下孵育，18 h后每12 h照胚1次，记录鸡胚死亡情况；收集18 h后的死胚及96 h仍存活鸡胚，无菌收取鸡胚尿囊液，并测定病毒血凝（HA）效价。利用High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒核酸，立即用于RT-PCR扩增或置-20 ℃保存备用。按照Primescript One Step RT-PCR Kit Ver.2（TaKaRa）说明书配置反应体系，分段扩增病毒基因组序列，基因组扩增引物见表1。利用SMARTer RACE 5'/3'试剂盒（Clontech）扩增病毒基因组5'和3'末端。RT-PCR产物送青岛睿博兴科生物科技有限公司测序。
利用Lasergene软件拼接和编辑基因组序列，分析病毒基因组结构和基因组核苷酸序列同源性，利用MEGA软件分析F、HN蛋白关键氨基酸位点。从GenBank中下载APMV-1~21代表株序列，利用MEGA软件进行遗传进化分析，采用邻位相连法（neighbor-joining）构建基因组遗传进化树，bootstrap设置为1 000次重复。2022年从我国福建省鸡群和江西省鸭群各分离到1株APMV-14，2株毒株均可在鸡胚中有效复制。病毒相关信息见表2。
2株毒株基因组长度均为15 444 nt，基因组结构均为3'-N-P-M-F-HN-L-5'，遵循“六碱基原则”；分离株3'前导序列和5'尾随序列长度均分别为55和277 nt，N、P、M、F和HN基因5'非转录区（untranslated region，UTR）均长于3'UTR，L基因3'UTR长于5'UTR，基因间隔区（intergenic sequence，IGS）长度为2~36 nt（表3）；各基因起始序列较保守，只有1个碱基差异，终止序列存在1~3 nt的差异（表4）。2株毒株F蛋白长度为541个氨基酸（amino acid，aa），与日本分离株11OG0352一致，F蛋白裂解位点为99REGR↓L103，具有低致病性禽副黏病毒的典型分子特征；F蛋白有5个潜在N-糖基化位点，分别位于73、180、433、457和483位；HN蛋白长度均为607 aa，长于日本分离株11OG0352（580 aa）；HN蛋白有7个潜在N-糖基化位点，分别位于119、148、278、346、377、390和584位。
从GenBank中下载APMV-1~21代表株各1株（表5），与我国分离的2株APMV-14进行基因组核苷酸序列同源性分析。结果（表6、图1）显示：我国分离的2株毒株高度同源（99.5%），与APMV-14代表株基因组同源性最高（91.0%），与其6个基因片段同源性为87.7%~92.0%；2株分离株与APMV-3同源性最低（45.0%），与其余APMV的核苷酸同源性为45.3%~52.3%。
病毒基因组遗传进化分析结果显示，我国分离的2株毒株与日本分离株（11OG0352）位于同一分支，均属于APMV-14型（图2）。
野鸟被认为是禽流感病毒、新城疫病毒等多种禽病病毒的贮存宿主。近年来，从野鸟中也分离到多种APMV，其中全球首株APMV-14毒株分离自日本野鸭粪便样本。从我国福建省和江西省分离的2株APMV-14毒株均来自家禽；但由于缺乏野鸟APMV-14监测数据，暂不清楚我国家禽中APMV-14的确切来源。目前，全球主要有8条候鸟迁徙路线，其中3条从我国经过，分别为东非—西亚迁徙线、中亚—印度迁徙线和东亚—澳大利亚迁徙线，每年从我国过境的候鸟种类和数量约占迁徙候鸟的20%~25%。福建省和江西省具有良好的生态环境和丰富的湿地资源，每年冬春季节都会吸引大量湿地水鸟前来越冬。湿地水鸟的大量迁徙可能会增加其与家禽接触的机会，进而导致APMV-14传播。因此，建议加强养殖场的生物安全管理，避免野鸟与家禽接触。APMV-14为单股负链RNA病毒，基因组由6个基因片段（N、P、M、F、HN、L）组成。本研究中的2株毒株基因组长度均为15 444 nt，与日本分离株11OG0352相同。虽然我国分离的2株毒株与日本APMV-14分离株（11OG0352）属于同一进化分支，但基因组核苷酸同源性仅为91.0%，且存在多处氨基酸差异。我国分离的2株毒株F蛋白裂解位点序列为REGR↓L，与日本分离株11OG0352存在1个氨基酸差异（REGK↓L）；HN蛋白长度为607 aa，明显长于日本分离株（580 aa）。研究显示，APMV-1 HN蛋白的长度与病毒毒力相关；而HN蛋白长度是否会影响病毒的生物学特性，还需进一步研究。2011年在日本野鸭粪便样本中首次分离到APMV-14后，10年内未见有分离到APMV-14毒株的其他报道。2022年，中国动物卫生与流行学中心禽病监测室分别于鸭和鸡的口咽/泄殖腔拭子样品中分离到2株APMV-14毒株。这2株毒株虽然宿主来源不同，但基因组核苷酸序列同源性高达99.5%，说明APMV-14已具备从水禽跨种传播至陆禽的能力。据推测，在分离到这2株毒株之前，我国野生水鸟和家禽中可能就已存在APMV-14流行。因此，今后还需要加强野鸟和家禽的APMV-14监测及其跨种传播机制研究。《我国新出现的禽副黏病毒14型基因组特性》详情请点击“阅读原文”。
