猪圆环病毒2型（PCV2）、猪肺炎支原体（M hyo）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）以及胞内劳森菌（LI）是当前养猪业中最主要的四种高致病性病原体，其对生猪的健康状况、动物福利及经济效益均构成严重威胁 [1, 2, 3, 4]。

PCV2是一种广泛感染猪的单链DNA病毒，可引发多种相关综合征，统称为猪圆环病毒病 [5, 6]，并且是PCV2全身性疾病的首要病原。PCV2感染会导致猪淋巴细胞减少并伴发淋巴组织肉芽肿性炎症，进而造成免疫功能削弱，使其更易继发其他感染。

猪肺炎支原体是一种缺乏细胞壁的细菌性病原体，可附着于气管、支气管及细支气管的纤毛上皮，导致黏膜清除系统受损 [7]。此外，它还会抑制免疫功能，增加猪对其他呼吸道感染的易感性 [8]。该病原体是猪地方性肺炎（一种猪的慢性呼吸道疾病）的主要病因，也是猪呼吸道疾病综合征的首要诱因之一 [9]。猪肺炎支原体感染在养猪地区广泛存在，由此导致的用药成本增加和猪群生产性能下降造成了严重的经济损失 [10]。

PRRSV是一种单股正链RNA病毒，可导致母猪繁殖障碍及各年龄段猪群的呼吸道疾病 [11, 12]。该病毒于1987年首次在北美被发现 [13]，随后于1990年在欧洲出现 [14]。根据分类，PRRSV可分为两个物种：乙型动脉病毒猪群1型（原名PRRSV-1或欧洲型）和乙型动脉病毒猪群2型（原名PRRSV-2或北美型）[15]。PCV2、猪肺炎支原体及PRRSV是猪呼吸道疾病综合征中临床意义最为显著的病原体。该综合征是一种多因素导致的复杂疾病，以生长育肥猪出现呼吸道症状和生长迟缓为主要特征 [16, 17]。

胞内劳森菌是一种专性胞内寄生菌，是引起猪增生性肠病的病原。该疾病表现为回肠和结肠隐窝肠细胞增生，进而引发多种临床症状。猪增生性肠病主要有两种临床形式：急性增生性出血性肠病和慢性猪肠道腺瘤病 [18]。急性型可导致出血性腹泻和猝死，主要侵害4至12月龄的青年猪；而慢性型则以腹泻或亚临床感染为特征，导致体重下降和生产性能损失，尤其多见于6至20周龄的猪群 [19]。

实践证明，疫苗接种结合良好的牧场管理，能有效预防或控制由PCV2、猪肺炎支原体、PRRSV及胞内劳森菌引起的猪场疾病。然而，由于目前尚无能够同时有效针对上述四种主要病原体的单一组合疫苗，养殖从业者通常需要依赖以下方案：使用单独的单价疫苗、PCV2与猪肺炎支原体的二联组合疫苗，或可在接种时临时混合使用的疫苗 [20]。

为了提升动物福利，减少多次接种引发的疼痛与应激反应，降低综合成本，并避免操作人员被针头刺伤、医源性感染传播以及肉产品中残留断针等风险，许多从业者和养殖场更倾向于使用针对主要病原体的单剂量组合疫苗，并借助无针注射设备进行接种。然而，开发一种能够同时满足安全性、有效性、保质期及成本等所有要求的此类组合疫苗，目前仍面临挑战。

作为初步探索，我们近期研究证实，四种皮内疫苗——猪圆环病毒疫苗（Porcilis PCV ID）、猪肺炎支原体单次接种疫苗（Porcilis M Hyo ID ONCE）、胞内劳森菌疫苗（Porcilis Lawsonia ID）及猪繁殖与呼吸综合征疫苗（Porcilis PRRS ID），可通过无针注射设备在同一解剖部位同时接种。该操作分别使用双喷嘴IDAL® 3G Twin（该设备可同时接种分装于两个独立瓶中的疫苗，德国Henke-Sass Wolf公司）和单喷嘴IDAL® 3G Mono（德国Henke-Sass Wolf公司）完成（Horsington 等，[21]）。

具体而言：PCV ID疫苗 为即用型制剂，其主要成分为PCV2病毒样颗粒，并含有佐剂X-Solve12 [22]。M Hyo ID ONCE疫苗 包含经灭活的全菌体猪肺炎支原体，并辅以佐剂X-Solve50 [23]。Lawsonia ID疫苗 为冻干灭活胞内劳森菌疫苗，使用前需使用X-Solve12佐剂或PCV ID疫苗进行重溶 [21, 24]。PRRSV疫苗 为PRRSV1减毒活疫苗，呈冻干形态，使用前需以Diluvac Forte佐剂重溶，可经皮内或肌肉途径接种 [25]。

在本研究中，我们展示了一种新开发的即用型组合疫苗——Porcilis® PCV M Hyo ID。该疫苗含有灭活的PCV2和猪肺炎支原体抗原，专为皮内接种设计。该疫苗旨在提升用户使用的便利性，降低疫苗接种成本，并减少对仔猪的注射次数。此外，通过减少医疗废弃物、降低包装成本以及节约运输与储存相关的能源和成本，该疫苗还致力于降低其在整个生命周期内的环境碳足迹。

本研究的主要目的在于评估新开发的PCV M Hyo ID组合疫苗针对PCV2及猪肺炎支原体感染的保护效力。次要目的则是评估该新型组合疫苗能否与Lawsonia ID疫苗混合，并同时与PRRS ID皮内疫苗在颈部同侧、同一时间进行接种，从而通过单次操作使猪群获得针对上述四种主要猪病的全面保护。疫苗效力通过针对各病原体的免疫攻毒试验得到了验证。

2.1 动物 

每次研究均使用了约3周龄、来自数窝的雌雄仔猪。所有仔猪均在断奶前完成免疫接种。

2.2 疫苗 

本研究所评估的疫苗包括PCV M Hyo ID、PRRS及Lawsonia ID。所有疫苗均采用IDAL® 3G Mono或Twin无针注射器进行皮内接种。IDAL Twin是一种双喷头皮内接种设备，其两个注射头间距3厘米，可单次操作同时接种两种疫苗，每种疫苗的接种体积均为0.2毫升。除PRRS疫苗外，其余疫苗均按照制造商推荐的剂量进行单独或联合接种。对于PRRS疫苗，其在PRRSV攻毒研究中的接种剂量为1 × 10^4 TCID50，而在其他研究中的剂量为1 × 10^6 TCID50。冻干PRRS疫苗使用Diluvac Forte佐剂进行重溶；冻干Lawsonia ID疫苗则使用PCV M Hyo ID疫苗或X-Solve12佐剂进行重溶。

2.3 PCV2研究设计与样本分析

选取血液中PCV2 DNA检测呈阴性、且PCV2母源抗体效价低于6 log2 [26] 的长白×大白杂交仔猪，将其分为三组，每组15头。约三周龄时，第一组仔猪（PCV-G1）通过IDAL® 3G Twin设备进行皮内接种，接种方案为：PCV M Hyo ID疫苗与Lawsonia ID疫苗混合后，与PRRS疫苗同时于颈部同侧接种。第二组（PCV-G2）仅接种PCV M Hyo ID疫苗。第三组（PCV-G3）不进行任何免疫，作为攻毒试验的对照组。

在免疫后两周（仔猪5周龄，研究第14天），对所有仔猪进行野生型PCV2b毒株I-12/11（分离自荷兰猪场）的攻毒。攻毒途径为经鼻腔接种，总剂量为5.8 log10 TCID50，总体积为6 mL（每侧鼻孔3 mL）。试验期间每日观察仔猪临床表现，并全程采集血液样本和粪便拭子。攻毒后三周，所有动物均通过电击致昏（> 250 V, > 1.3 A）后放血处死。剖检采集腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、扁桃体及肺组织样本，用于PCV2核酸检测。

血清样本经离心分离后，于-20°C条件下冷冻保存待检。按照既往研究[26]所述方法，采用酶联免疫吸附试验检测血清中抗PCV2抗体水平。

使用商用试剂盒（Roche, Magnapure 96 with DNA/viral NA SV kit）对血清、直肠拭子及组织匀浆中的DNA进行提取，随后通过定制qPCR方法对PCV2 DNA进行定量检测。qPCR反应采用针对PCV2-ORF2设计的特异性引物及双水解探针。所用引物序列为：

F1: 5’- GTA ACG GGA GTG GTA GGA GAA -3’F2: 5’- GTA GCG GGA GTG GTA GGA GAA -3’R1: 5’- GCC ACA GCC CTA ACC TAT GAC -3’R2: 5’- GCC ACA GCC CTC ACC TAT GAC -3’探针序列为：5’- 6FAM- ATG TAA ACT ACT CCT CCC GCC ATA CCA TA -BHQ1-3’

扩增循环数与含已知浓度PCV2-ORF2质粒的标准品进行比对，最终结果以每微升DNA提取物中所含log10拷贝数表示。检测值低于1.00 log10拷贝数/µl的样本判定为阴性，在计算时按0.00 log10拷贝数/µl处理。

在约三周龄时（研究第0天），PRRS-G1组仔猪的接种方案与前述PCV-G1组完全相同。PRRS-G2组仅接种PRRS疫苗。PRRS-G3组不进行免疫，作为攻毒对照组。免疫后四周（仔猪7周龄，研究第28天），对所有仔猪使用强毒力PRRSV 1型野毒株（分离自荷兰猪场的2号分离株）进行攻毒。攻毒途径为经鼻腔接种，总剂量为5.3 log10 TCID50，总体积为2 mL（每侧鼻孔1 mL）。研究期间每日观察仔猪临床表现，并从攻毒前一日至攻毒后14天（研究第27至42天）每日记录直肠温度。分别于研究第27天和第56天（研究结束）称量体重，计算每头仔猪的平均日增重，并按组别进行统计。在研究第0天、第27天和第56天采集血液样本，分离血清后于-20°C保存待检。使用ELISA检测试剂盒（IDEXX PRRS X3）按照制造商说明检测抗PRRSV抗体，该试剂盒判定S/P值≥0.4为阳性。血清中PRRSV病毒含量通过猪肺泡巨噬细胞滴定法进行定量：将待测样本进行10倍系列稀释（每个稀释度6个重复孔），接种PAM细胞后于37°C培养，6-7天后观察细胞病变效应。病毒滴度采用Spearman-Kärber法计算，结果以log10 TCID50/mL表示。研究第56天，所有动物均通过电击致昏（> 250 V, > 1.3 A）后放血处死。

2.4 猪肺炎支原体（M hyo）研究设计与样本分析

选取长白×大白杂交仔猪，其猪肺炎支原体（M hyo）、PRRSV及胞内劳森菌（LI）抗体效价均为阴性，且PCV2抗体效价低于6 log2。将合格仔猪分为2个处理组，每组20头。约三周龄时，M hyo-G1组仔猪通过IDAL 3G Twin设备进行皮内接种，接种方案为：PCV M Hyo ID疫苗与Lawsonia ID疫苗混合后，与PRRS疫苗（非混合）于颈部同侧同时接种。M hyo-G2组仅接种PRRS疫苗，作为攻毒对照组。

免疫后四周（仔猪7周龄），对所有动物使用强毒力丹麦猪肺炎支原体野毒分离株进行攻毒。攻毒途径为气管内接种，连续两天进行，每日接种纯培养物10毫升（首日攻毒剂量为10^9颜色变化单位/毫升，次日为10^8颜色变化单位/毫升）。分别于免疫前、攻毒前及剖检时采集血液样本。血清样本按照制造商说明书，采用IDEXX®猪肺炎支原体抗体检测试剂盒及IDEXX® PRRS X3抗体检测试剂盒进行抗体检测。攻毒感染三周后，所有动物通过电击致昏（> 250 V, > 1.3 A）后放血实施安乐死，并进行肺部病变检查。肺部病变评分严格依据欧洲药典专论2448标准执行。

2.5 胞内劳森菌（Lawsonia）研究设计与样本分析

选用杜洛克×约克夏杂交仔猪，其胞内劳森菌（LI）母源抗体为阴性或低水平（

分别于攻毒前一日及攻毒后第6、13、20天称量体重，计算每头动物的平均日增重，并按组别进行统计。

攻毒后三周（研究第49天），所有猪只通过电击致昏（> 250 V, > 1.3 A）后放血实施安乐死，并进行剖检。剖检时重点检查肠道，特别是回肠（即小肠远端50厘米段）是否有提示PPE的病变。采集每头动物的粪便样本（来自直肠）和回肠黏膜样本（回盲连接处上方5厘米），用于LI特异性qPCR检测。此外，采集回肠组织样本，经4%缓冲福尔马林固定、石蜡包埋并制作切片，分别进行苏木精-伊红（HE）染色和采用抗LI单克隆抗体的免疫组织化学（IHC）染色，最后进行显微镜检查。

回肠黏膜病变首先参照既往研究方法进行肉眼观评分[24]，并按以下公式估算回肠受累百分比：回肠受累百分比 =（受累回肠长度 / 回肠总长度）× 100。回肠病变总分通过回肠黏膜评分与回肠受累百分比的乘积计算得出，最终统计各处理组的平均回肠病变总分。

组织学评分（HE评分与IHC评分）参照既往研究方法进行[24]。组织学总分为HE评分与IHC评分的乘积，最终计算各组的平均组织学总分。

于研究第0、28及49天采集血液样本并分离血清，保存于-20°C待检。采用既往研究所述的胞内劳森菌抗体ELISA方法对血清样本进行检测[24]。使用商用试剂盒（Roche, Magnapure 96 with DNA/viral NA SV kit）从0.2克粪便或黏膜样本中提取DNA，并通过既往研究建立的qPCR方法对胞内劳森菌DNA进行定量检测[24]。

2.6 统计学分析

采用SAS统计软件（SAS Institute Inc.，美国北卡罗来纳州卡里）开展数据分析，具体如下：所有假设检验均采用双侧检验，显著性水平设定为α=0.05。

2.6.1 PCV2数据分析

抗体效价分析：采用方差分析法对免疫接种时的PCV2抗体效价进行分析。以免疫接种时的抗体效价作为协变量，采用协方差分析法对攻毒时的PCV2抗体效价进行分析。采用重复测量方差分析法对攻毒后的PCV2抗体效价进行分析。

病毒载量分析：对于血清和直肠拭子中的病毒载量，攻毒后的qPCR结果采用梯形法则计算曲线下面积，并应用Kruskal-Wallis检验进行分析。对各淋巴组织/器官中的qPCR结果，均采用Kruskal-Wallis检验进行分析。

2.6.2 PRRSV数据分析

体温分析：采用重复测量的协方差分析法对攻毒后体温进行统计分析，以攻毒前平均体温作为协变量。平均日增重分析：采用协方差分析法对平均日增重进行统计分析，以攻毒前体重作为协变量。病毒血症分析：攻毒后的PRRSV病毒血症通过计算曲线下面积进行分析。计算中，将病毒滴度

2.6.3 猪肺炎支原体数据分析

肺部病变评分：采用威尔科克森秩和检验进行分析。抗体效价：采用描述性统计学方法进行评估，结果以平均值±标准差的形式呈现。

2.6.4 胞内劳森菌（Lawsonia）数据分析

腹泻评分与平均日增重：对第13至21天的腹泻评分，采用累积logit模型[27]进行统计分析，该模型通过广义估计方程（GEE）校正重复测量数据间的相关性，其P值基于经验标准误计算。计算该期间（第13至20天）的平均日增重，并以第13天体重作为协变量，采用协方差分析法进行统计比较，组间差异进一步使用图基事后检验进行两两比较。

qPCR数据：粪便与回肠黏膜样本的qPCR数据经log10对数转换（预先加1以排除零值），结果以log10皮克DNA/微升表示。数据以平均值及95%置信区间图示，若区间无重叠则提示存在统计学显著性。同时，采用线性梯形法则计算曲线下面积，作为评估病原体持续排毒情况的综合指标。分别对粪便qPCR数据的AUC、第21天的粪便qPCR数据以及第21天的回肠黏膜qPCR数据，采用方差分析法进行统计检验，并运用图基事后检验进行组间比较。

病理评分与死亡率分析：回肠病变与组织学评分：对肉眼观察回肠病变总分及组织学总分，采用基于似然比检验的累积logit模型进行统计分析。此处定义的比值比，指疫苗接种组病变评分处于较低等级的几率相对于对照组的比值。死亡率分析：采用广义线性混合模型对死亡率进行评估，该模型针对二项分布数据构建，使用logit连接函数，并将处理组别作为固定效应。

3.1 针对PCV2攻毒的保护效果

3.2 针对猪肺炎支原体攻毒的保护效果

3.3 针对PRRSV攻毒的保护效果

3.4 针对胞内劳森菌（LI）攻毒的保护效果

在研究第32天，Laws-G3组中一头猪因出现进行性运动及神经症状（达到人道终点）被实施安乐死。剖检发现其右侧跗关节、腹腔及脑膜存在纤维素性多浆膜炎，并从跗关节和脑膜分离到猪链球菌。

接种联合疫苗的猪只（Laws-G1）与单独接种Lawsonia ID疫苗的猪只产生了相似的LI抗体反应（图3）。与未接种疫苗的对照组相比，Laws-G1和Laws-G2两组猪只均表现出平均日增重的显著增加，以及腹泻评分、粪便和回肠黏膜中的LI DNA载量、肉眼回肠病变评分和组织学回肠评分的显著降低（表3）。

新研发的PCV M Hyo ID组合疫苗对PCV2和猪肺炎支原体感染均具有显著保护效力，其效力与分别接种PCV2和猪肺炎支原体单价皮内疫苗的效果相当[21]。此外，该组合疫苗可与Lawsonia ID疫苗无缝配伍，并与PRRS疫苗在颈部同侧同时接种，通过单次操作即可提供针对这四种主要猪病的全面保护。这一进展代表了猪群健康管理的重要进步，具有节省时间、降低劳动力成本、通过减少注射次数和操作程序改善动物福利，以及降低疫苗能源足迹等多重优势。

我们先前的研究已证实，在同一解剖部位使用单价疫苗进行PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体和胞内劳森菌的皮内接种，在不影响疫苗安全性和有效性的前提下是可行的[21]。为进一步提升用户便利性、减少注射次数并降低疫苗对环境的影响，我们开发了即用型组合疫苗PCV M Hyo ID。本研究旨在评估这种新型双效疫苗的效力，及其与Lawsonia ID和PRRS疫苗使用IDAL® 3G Twin皮内接种设备在同一解剖部位联合使用时，对PCV2、猪肺炎支原体、PRRSV和胞内劳森菌感染的保护效果，同时确保不影响疫苗效力。

针对每种病原体进行的攻毒试验表明，联合接种与单独接种（或在猪肺炎支原体攻毒试验中与PRRSV疫苗比较）提供的保护效力相当。单价疫苗与联合疫苗接种的安全性特征相似，且均符合各疫苗本身特性（数据未显示）。在PCV2攻毒试验中，联合接种组和单独接种组均观察到病毒血症和病毒载量的显著降低。在PRRSV攻毒试验中，与对照组相比，联合接种组和单独接种组的病毒血症均显著减轻，平均日增重显著提高。与既往研究[21]结果不同之处在于，本研究中单独接种组在抑制病毒血症方面显示出优于联合接种组的保护效果（p

值得注意的是，在猪肺炎支原体攻毒试验中，联合接种组的肺部病变评分较对照组显著降低；在胞内劳森菌攻毒试验中，联合接种组和单独接种组均表现出平均日增重的显著提高，以及腹泻评分、粪便和回肠黏膜LI DNA载量、肉眼回肠病变评分和组织学评分的显著下降（表3）。

PRRS疫苗属于减毒活疫苗，且已知PRRSV具有免疫抑制作用。既往研究报道，PRRSV感染或使用PRRSV减毒活疫苗会降低猪肺炎支原体疫苗的效力[28]。然而与之相反，在使用PCV ID、M Hyo ID、Lawsonia ID及猪细小病毒疫苗时，并未观察到PRRS疫苗接种带来的干扰效应[29, 30, 21]。本研究中，除PRRSV攻毒试验中的病毒血症指标外，在接受联合疫苗接种的组别与接受单价疫苗接种的组别之间，未观察到临床症状及各病原攻毒临床保护效果的显著差异，这表明疫苗之间不存在相互干扰，同时接种也未对效力产生负面影响。

在集约化养猪生产中，疫苗接种等常规操作涉及抓持和疼痛，可能对猪的免疫状态及整体健康产生不利影响[31, 32, 33]。通过减少抓持次数和疫苗接种操作频次，并采用皮内途径接种所有主要病原疫苗，可实现对动物福利的积极改善[33, 34]。本研究结果表明，使用无针注射设备（如IDAL® 3G或IDAL® 3G Twin）进行皮内接种，操作简便快捷，兼具无针和皮内接种的附加优势，有效提升了操作便利性并改善了动物福利。

该组合疫苗配方的核心优势之一，在于其为更广泛的疾病管理方案提供了灵活性。本研究证实，PCV M Hyo ID疫苗可与LI疫苗通过相同皮内途径成功混合接种，从而针对另一种影响猪群的主要胃肠道病原体提供额外保护。此外，该皮内疫苗还可通过双头皮内接种设备与PRRSV疫苗同步施用。这一特点使得通过单次操作即可同时预防四种主要疾病（PCV2、猪肺炎支原体、PRRSV及胞内劳森菌）成为可能，显著拓展了单次操作可实现的预防范围。此类策略不仅优化了疫苗接种流程，还通过减少所需操作次数最大程度减轻动物的应激与不适——而先前研究已证实多次操作与动物应激及潜在免疫反应影响存在关联。

从经济与环境视角来看，该组合疫苗的应用能带来显著效益。疫苗的整合意味着所需单剂次减少，从而降低了生产需求以及相应的制造、包装、储存和运输成本。这有助于减少能源消耗及整体碳足迹，顺应了在兽医和畜牧业中日益受到重视的可持续发展理念。

在实际应用层面，这种皮内组合疫苗接种方案在劳动效率与资源优化至关重要的养猪生产环境中极具优势。通过单次操作即可接种预防四种不同疾病的疫苗，有效解决了养猪生产者面临的操作难题——这在劳动力持续短缺且成本效率备受关注的大型养殖场中尤为重要。每头动物操作时间的缩短不仅提升了养殖场生产效率，还通过减少重复操作引发的应激反应，支持了更人道的管理实践。

最后，皮内接种途径本身即为猪用疫苗注射提供了一个前景广阔的方向。研究证实，皮内接种在产生强劲免疫应答的同时具有微创特性，有助于在畜牧业生产中更好地符合动物福利标准。与传统肌肉注射相比，该方法引发的动物不适更少，也符合消费者与监管部门对经济动物人道对待的期望。

本研究成功开发了针对PCV2和猪肺炎支原体感染的新型组合疫苗PCV M Hyo ID，其保护效力与相应单价疫苗相当。该疫苗可与Lawsonia ID疫苗无缝配伍，并与PRRS皮内疫苗在颈部同侧同步接种，通过单次操作即可提供针对四种主要猪病的全面保护。该方案在保证疫苗效力的同时，兼具经济、环保及动物福利优势，为猪群健康管理提供了更可持续且人道的解决方案。未来研究应致力于探索将四种抗原整合至单一疫苗的可能性，并进一步研究与其他疫苗的配伍潜力，以扩大对猪群健康的保护范围。