江苏农科院李彬团队发表于“Veterinary Microbiology”，题名为“Molecular characteristics of the immune escape of coronavirus PEDV under the pressure of vaccine immunity”的文章。

摘要

冠状病毒在疫苗和环境因素带来的免疫压力作用下，发生了进化与突变，导致突破性感染时引发的后果更为严重。然而，冠状病毒的进化突变与免疫压力之间的具体关联仍不明确。猪冠状病毒 - 猪流行性腹泻病毒（PEDV） 已存在数十年。本研究通过体内制备抗PEDV的多克隆抗体，并经体外连续传代鉴定出关键中和表位。随后成功构建了重组突变株，体外实验证实rA1273P 株具备逃逸多克隆抗体中和作用的能力。体外细胞研究与体内动物实验均表明，该毒株在规避疫苗接种后的抗体压力时，仍能维持毒力与致病性。该菌株在逃逸免疫压力时的致病性与野生型毒株相当。通过对比疫苗株与临床株的 S 蛋白基因，发现临床株的 1273 位氨基酸存在突变。总的来说，本研究通过连续传代，在免疫压力下鉴定出一个新型PEDV S 蛋白中和位点，表明 1273 位氨基酸在长期抗体压力下易发生突变，从而增强病毒的宿主逃逸能力。本研究为解析冠状病毒逃逸免疫压力的机制提供了新见解，并为监测和预测冠状病毒的变异进化提供了技术支持。

研究意义

冠状病毒因其高度变异性，构成了持续存在的公共卫生威胁。2010 年以来，高致病性 PEDV 毒株的出现给全球养猪业带来重大经济损失。PEDV 在外界免疫压力下进化变异，使其防控难度日益增加。我们通过一系列体外传代实验，成功制备抗 PEDV 多克隆抗体并鉴定出 S 蛋白上一个新的中和表位（第 1273 位氨基酸）；进一步研究发现，该蛋白的 A1273P 突变虽未改变 PEDV 的致病能力，却能显著提升其在体内外逃避宿主免疫、感染宿主的效率。最后发现，临床 PEDV 毒株 S 基因第 1273 位氨基酸位点存在不同程度突变，该研究为冠状病毒进化变异与免疫压力的特异性关联提供了依据。

关键词

冠状病毒；猪流行性腹泻病毒（PEDV）；免疫逃逸；免疫压力；S 蛋白（刺突蛋白）

冠状病毒可导致人类和动物出现多种呼吸道、胃肠道及中枢神经系统疾病，严重威胁人类健康并造成沉重经济负担。从分类学分类来看，冠状病毒归属于网巢病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属；该属病毒具有包膜，基因组类型为线性单链正义 RNA。该病毒基因组编码四种核心结构蛋白，分别为核衣壳蛋白（N）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和刺突蛋白（S）。其中 S 蛋白通过其受体结合域与 N 端结构域介导病毒包膜与宿主细胞受体的结合，这一过程是病毒与宿主细胞融合的关键。冠状病毒可通过突变和重组（尤其是 S 蛋白结合位点的特异性突变）主动适应新环境，这种适应能力不仅能让病毒有效拓展宿主范围、改变组织嗜性，还会显著影响其致病性、传播效率及宿主感染后的免疫反应。因此，阐明冠状病毒新发变异株的临床特征、解析病毒突变的进化模式，可为预测未来变异株涌现及筛选关键中和抗体结合位点提供全新视角，这对遏制疾病传播、预防后续疫情暴发具有关键意义。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于 α 冠状病毒属，最早于 20 世纪 70 年代在英国和比利时被发现。2010 年以前，由于 PEDV CV777 株灭活疫苗和减毒疫苗的广泛使用，我国的 PEDV G1a 经典亚群仅造成零星散发和区域性疫情，感染率得到有效控制。然而 2010 年 10 月，我国南方省份突发高致病性 PEDV G2a 变异株，其迅速扩散至全国。即便接种了经典疫苗的猪场，新生仔猪也全部死亡，死亡率达 100%。2013 年，美国也出现了 G2b 型高致病性 PEDV，导致全国猪群 10% 死亡，且快速蔓延至全球多国，给全球养猪业带来巨额损失。G2b 毒株暴发后，美国又出现了一株新变异株，其 S 基因存在大量核苷酸插入缺失，该毒株被命名为 S-INDEL 毒株。我国虽已广泛应用针对 PEDV G1、G2 亚群的商品化疫苗，但近期流行病学数据显示，近年 PEDV 流行率与感染率仍居高不下，给我国养猪业带来了严峻挑战。

大量研究证实，S 蛋白突变是导致 PEDV 毒力和感染性改变的主要因素。目前已在 S 蛋白中发现至少五个中和表位区域，分别为 N 端结构域 S10 表位（NTD/S10）、核心中和表位 COE、S1D 结构域 SS2 表位、SS6 表位及 C 端 2C10 表位，此外，C 端的 2C10 表位区域也在其中。对不同亚型代表毒株 S 蛋白氨基酸序列的比较分析显示，同一亚型毒株的遗传变异程度较低，而不同亚型毒株的 S 基因差异显著；S 蛋白的最大差异区域为 N 端 1-400 位氨基酸，该区域包含完整的 S10 中和表位。对疫苗株 CV777、ZJ08 及不同亚型多种参考毒株的 S 蛋白氨基酸序列进行比对分析后发现，SS2 和 2C10 中和表位的保守性最强，SS6 与核心中和表位 COE 的变异性则更为明显。相较于 CV777、ZJ08 等 G1b 疫苗株，SS6 表位存在丝氨酸残基 L763S 和 D765S 替换；COE 表位的氨基酸变异较为复杂，G2c 亚型与 S-INDEL 毒株在该表位的第 516、548、593、632 位共享相同氨基酸替换，G2a 与 G2b 亚型则有不同程度的氨基酸置换。研究已证实，S 基因序列的突变是PEDV毒力变化的主要驱动因素，但 S 基因中发挥关键作用的特定核心氨基酸突变仍不明确。

本研究拟在抗体压力下系统筛选可逃逸多种中和抗体的 PEDV 变异株，明确中和抗体靶向的关键氨基酸残基，分析这些残基变异对病毒特性的影响，并通过动物实验验证其在 PEDV 致病及 S 蛋白介导的抗体中和中的功能。研究结果有望为提升疫苗效价与安全性提供新的科学支撑，对抗体类疗法及疫苗应用过程中耐药性风险的监测与评估具有重要理论和实践价值。

材料和方法

病毒和细胞

病毒：PEDV AH2012/12 株（GenBank 登录号：KU646831）本实验室分离和保存。

病毒维持液：含 5 μg/mL 胰蛋白酶（Sigma）和 37.5 μg/mL 胰酶（Sigma）的DMEM培养基（Gibco，美国）。

细胞：非洲绿猴肾细胞（Vero 细胞，ATCC 编号：CCL-81），生长液为含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基，培养条件为 37°C、5% 二氧化碳。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）多克隆抗体（pAb）的制备

将纯化的PEDV浓缩病毒液经0.1%甲醛溶液于37°C灭活2小时后，加弗氏完全佐剂乳化。选取1头4周龄SPF级仔猪，免疫4次，每次间隔4周。末次免疫5天后，采集血液，37°C处理2小时后 12 000转/分钟离心5分钟取血清，于-20°C以下进行保存｡

通过连续传代获得多克隆抗体逃逸株

首先，将 PEDV AH2012/12 株与多克隆抗体（pAb，稀释比例1:10）混合，于37°C作用1小时。随后，将该混合物接种至24孔板中的Vero细胞单层，37°C 孵育2小时后，弃去混合物，并用DMEM洗涤3次。随后，加入含多克隆抗体（pAb，稀释比例 1:10）、5 μg/mL 胰蛋白酶及 37.5 μg/mL 胰酶的培养基，继续培养。同时设置对照组：Vero 细胞接种 PEDV AH2012/12 株，且培养体系中不含 pAb。待观察到细胞病变效应（CPE）后，收集病毒并用于下一代的多克隆抗体压力传代。若48小时后未观察到CPE，则将细胞洗涤 2 次，培养基更换为含5 μg/mL 胰蛋白酶及 37.5 μg/mL 胰酶但不含多克隆抗体（pAb）的DMEM，继续培养直至观察到 CPE。每传10代 后，对 AH2012/12 株的 S 基因进行测序。当两组（实验组与对照组）同时观察到 CPE 时，终止该多克隆抗体压力下的病毒连续传代。

PEDV重组病毒的构建

重组PEDV毒株采用CRISPR/Cas9 技术构建，通过重叠PCR和体外转录技术，分别构建了3对靶向 PEDV S 基因的单向导 RNA（sgRNA）。PCR 扩增以 sgRNA-F/sgRNA-R 引物对和恒定反向引物 Scaffold 寡核苷酸为引物进行。PCR 反应采用 SuperFi-Green PCR 预混液（Invitrogen）进行，反应程序如下：98°C 预变性 3 分钟，随后进行 34 个循环（98°C 变性 30 秒、55°C 退火 30 秒、72°C 延伸 30 秒），最后 72°C 终延伸 5 分钟。之后，使用 DNA 纯化试剂盒（Omega Bio-tek）对 PCR 扩增产物进行纯化，纯化后的产物用作单向导 RNA（sgRNA）转录的模板。单向导 RNA（sgRNA）的转录反应体系为 20 µL，包含 2 µL 10× 转录缓冲液、2 mM 三磷酸核苷（NTPs）、40 单位核糖核酸酶抑制剂（RNase inhibitor，TaKaRa）、1 µL 二硫苏糖醇（DTT）及 100 单位 T7 RNA 聚合酶（NEB），于 37°C 孵育过夜。转录产物经酚 - 氯仿法纯化后，溶于无核糖核酸酶（RNase-free）水中。随后，采用 CRISPR/Cas9 技术对携带 AH2012/12 株基因组的重组细菌人工染色体（BAC）质粒进行体外酶切。酶切后的重组 BAC 质粒经纯化后，使用 In-Fusion 克隆试剂盒（TaKaRa）通过同源重组将同源重组片段连接至 BAC 质粒中。通过聚合酶链式反应（PCR）及桑格测序（Sanger sequencing，中国南京擎科生物科技有限公司）验证阳性克隆中目标序列的正确性。本研究使用的引物序列详见补充表 S1（Table S1）。

病毒噬斑试验

将PEDV病毒液进行 10 倍系列稀释后，加入铺满Vero细胞单层的 6 孔板作用 1.5 小时（37°C）。随后，用DMEM洗涤细胞 2 次以去除未吸附的病毒，接着向每孔加入 2 mL 含 1.5% 甲基纤维素、5 μg/mL 胰蛋白酶及 37.5 μg/mL 胰酶的 DMEM 培养基作为覆盖液。37°C 孵育 48 小时后，用 4% 多聚甲醛固定细胞，再以 0.1% 结晶紫进行染色。

病毒生长动力学分析

将相应PEDV以 0.1 MOI接种至 24 孔板中的Vero细胞单层，37°C 孵育 1.5 小时。孵育结束后，用DMEM洗涤细胞 2 次后弃去病毒上清液，随后向每孔加入 500 μL 含 5 μg/mL 胰蛋白酶及 37.5 μg/mL 胰酶的 DMEM 培养基。在多个时间点收集细胞上清液，采用TCID₅₀法测定病毒滴度。

免疫荧光试验（IFA）

将相应的PEDV以 0.1MOI感染 48 孔板中的Vero细胞单层。感染 24 小时后，去除上清液，用 4% 多聚甲醛于室温固定细胞 15 分钟；随后用预冷甲醇溶液固定 10 分钟，再以 5% 脱脂奶于 37°C 封闭 1 小时。之后PBS洗涤细胞 3 次，加入小鼠抗 PEDV N 蛋白单克隆抗体（稀释比例 1:500）孵育 1 小时；PBS 洗涤 3 次后，加入FITC偶联的山羊抗小鼠 IgG 抗体（稀释比例 1:2000）及 0.1%DAPI，于室温孵育 1 小时。最后用 PBS 洗涤细胞 3 次，在荧光显微镜（尼康，Nikon）下观察荧光分布情况。

病毒中和试验

为测定多克隆抗体（pAb）对相应PEDV的中和能力，参照 Song 等人先前描述的方法进行多克隆抗体中和试验。简要步骤如下：首先将多克隆抗体于 56℃灭活 30 分钟，随后进行倍比稀释，与等体积的PEDV（200 TCID₅₀/100 µL）混合；混合物于 37℃作用 1 小时后，加入终浓度为 10 µg/mL的胰蛋白酶；随后将该抗体-病毒混合物接种至 96 孔细胞培养板中的Vero 细胞单层；37℃孵育 2.5 小时后，弃去混合物，用DMEM洗涤细胞三次；最后连续观察 3-5 天，记录CPE的发生情况。

RNA 提取与实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）

采用总 RNA 提取试剂盒从感染相应PEDV的Vero 细胞、肠道拭子或组织样本中提取总 RNA。随后使用 HiScript II Q RT SuperMix 逆转录试剂盒将 RNA 逆转录为cDNA。RT-qPCR 实验在 ABI QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 系统上进行，所用试剂为 SYBR Green PCR Master Mix。对于 Vero 细胞样本，以GAPDH基因为内参基因，采用 2-ΔΔCt 法对 PEDV 核蛋白（N）基因的 mRNA 表达水平进行归一化处理并计算相对表达量；对于粪便拭子或肠道组织样本，采用绝对荧光定量 PCR 法检测病毒 RNA 含量。所用PEDV-N基因的引物及探针序列如下：上游引物：5′-CTGTTGTTGCCATTGCCACGA-3′；下游引物5′-GTCTGAAAAGCCAATCATTC-3′；探针：5′-TTGCCTCTGTTGTTACTC-3′。

多克隆抗体对PEDV吸附的抑制作用

为探究多克隆抗体（pAb）对病毒吸附过程的影响，实验步骤如下：将稀释比例为 1:10 的 pAb 与 PEDV 在 37℃下作用 1 小时；随后将 Vero 细胞于 4℃预冷 30 分钟，加入上述抗体-病毒混合物并在 4℃下孵育 1 小时，该条件仅允许病毒结合细胞表面而不发生内化；用冰预冷的PBS洗涤细胞三次，以去除未结合的游离病毒。取部分细胞提取总 RNA，用于评估 pAb 对 PEDV 吸附的抑制效果；剩余细胞经固定、封闭处理后进行IFA检测，通过蔡司（Zeiss）激光共聚焦荧光显微镜观察荧光分布情况，并采用 Image J 软件对绿色荧光强度进行定量分析。

免疫印迹分析

将6孔板中的 Vero 细胞用PEDV AH2012 株以 0.1 MOI进行感染，同时设置 mock 感染组（模拟感染组，即未感染病毒的对照组）。感染后 24 小时（hpi），用预冷的PBS洗涤细胞，随后加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀测定缓冲液裂解细胞。免疫印迹实验步骤如下：将细胞裂解液于 100℃煮沸 10 分钟进行变性处理；SDS-PAGE对蛋白进行分离；采用电转印法将凝胶中的蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上；用含 5% 脱脂奶粉的 PBS 封闭膜后，加入多克隆抗体（pAb）于 37℃孵育 1 小时；用含吐温的 Tris 缓冲盐溶液（TBST）洗涤膜三次，随后加入HRP标记的二抗，室温孵育 1 小时；最后，使用 Western ECL 化学发光底物，通过伯乐（Bio-Rad）ChemiDoc 成像系统进行蛋白信号检测。

重组PEDV毒株的致病性评估

选取 15 头 5 日龄、PEDV抗原与抗体均为阴性的仔猪，随机分为三组（每组 5 头）：rAH2012/12 组、rA1273P 组及对照组。每组仔猪经口服途径接种指定病毒，接种剂量为 1×10^4.5TCID₅₀。攻毒后每日观察仔猪临床症状，同时采集肛拭子，通过RT-qPCR检测排毒情况。当仔猪出现死亡或实验结束时，对其实施安乐死，取小肠组织放入 10% 甲醛溶液中固定，用于后续HE 染色及免疫组织化学分析。

免疫 AH2012/12 疫苗后对仔猪的攻毒试验

选取 25 头 5 日龄、PEDV抗原与抗体均为阴性的仔猪，随机分为 5 组（每组 5 头），分室饲养。免疫组仔猪肌肉注射 PEDV 灭活疫苗，对照组仔猪则肌肉注射PBS。疫苗接种后 14 天（dpv），对免疫组仔猪进行加强免疫。分别于免疫前、免疫后 14 天及 24 天采集仔猪血清，用于后续相关检测。疫苗接种后 24 天（dpv），仔猪口服PEDV进行攻毒，剂量为2.0×10⁶TCID₅₀。攻毒后每日观察仔猪临床症状，同时采集肛拭子，采用RT-qPCR检测排毒情况。当仔猪出现死亡或实验结束时，对其实施安乐死，取小肠组织放入 10% 甲醛溶液中固定，用于后续HE 染色及免疫组织化学分析。

PEDV S 蛋白的建模分析

采用 AlphaFold3 软件对亲本毒株及 rA1273P 毒株的七肽重复区（HR 区）和 S 蛋白结构进行分析。AlphaFold3 通过其公共网络服（https://www.alphafoldserver.com）运行，建模得到的三级结构采用 PyMOL 软件进行可视化处理及对比分析。

统计学分析

所有数据均以平均值 ± 标准差（SD）表示，采用 GraphPad Prism 8 软件（GraphPad Software, Inc.）进行统计学分析。两组间比较采用双尾非配对 t 检验，多组间比较采用 Bonferroni 多重比较检验。统计学显著性标注如下：* 表示 P < 0.05；** 表示 P < 0.01；*** 表示 P < 0.001。

结果

PEDV S 蛋白在抗体压力下发生多点突变

为模拟PEDV在治疗性抗体压力下的进化过程，本研究制备了高免血清（多克隆抗体，pAb）。间接免疫荧光试验（IFA）结果显示，该 pAb 可与过表达的 S 蛋白及 PEDV 感染的细胞发生特异性结合（图 1A）；免疫印迹试验（Western blotting）同样证实，该 pAb 能与过表达的 S 蛋白特异性结合（图 1B）。为测定多克隆抗体（pAb）对PEDV的中和能力，本研究开展了病毒中和试验。间接免疫荧光试验（IFA）结果显示，该 pAb 能有效中和病毒感染，减少受感染细胞数量（图 1C）。此外，IFA 与RT-qPCR结果共同表明，该 pAb 可显著抑制 PEDV 的吸附过程（图 1D~F）。为筛选多克隆抗体（pAb）的关键作用位点，本研究在抗体压力下对PEDV进行连续传代，获得 pAb 逃逸突变株。病毒中和试验结果显示，pAb 对抗体压力下传代至第 20 代、30 代和 40 代的病毒，其中和抗体效价呈逐步下降趋势，而对第 10 代病毒的中和效价无变化（图 1G）。生长动力学与噬斑试验结果显示，抗体压力筛选获得的病毒与野生型毒株无显著差异（图 1H、I）。对不同代次的原始病毒及抗体压力下的病毒 S 基因进行测序分析，结果显示：第 10 代病毒的第 976 位氨基酸发生酪氨酸（Y）→组氨酸（H）突变；第 20 代病毒的第 1005 位氨基酸发生丝氨酸（S）→丙氨酸（A）突变；第 30 代病毒的第 1273 位氨基酸发生丙氨酸（A）→脯氨酸（P）突变（图 1J）。这些中和压力下关键氨基酸位点的突变，提示冠状病毒可能存在逃避宿主免疫应答的潜在机制。

图 1 抗体压力下猪流行性腹泻病毒（PEDV）S 蛋白发生多点突变。（A）通过间接免疫荧光试验（IFA）鉴定 PEDV 多克隆抗体（pAb）。（B）通过蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定 PEDV 多克隆抗体（pAb）。（C）通过间接免疫荧光试验（IFA）检测多克隆抗体（pAb）对病毒的中和作用。（D）间接免疫荧光试验（IFA）结果显示多克隆抗体（pAb）可抑制病毒吸附。（E）使用 Image J 软件对绿色荧光强度进行定量分析。（F）实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）结果表明多克隆抗体（pAb）可抑制病毒吸附。（G）多克隆抗体（pAb）对不同病毒的中和作用。（H）病毒连续传代的生长曲线。（I）病毒连续传代的空斑试验结果。（J）压力条件下不同传代后 PEDV S 基因的测序结果。

重组PEDV毒株的构建及特性分析

为验证上述三个氨基酸位点的功能意义，本研究利用反向遗传系统成功构建了三株重组毒株，分别命名为 rY976H、rS1005A 和 rA1273P，测序结果证实各突变位点均正确插入（图 2A）。为评估上述突变毒株的特性，本研究开展了致病性观察与生长曲线测定实验。间接免疫荧光试验（IFA）结果显示，各重组毒株均能感染细胞，并诱导产生与野生型毒株相似的细胞病变效应（图 2B）。病毒生长动力学分析表明，重组毒株与野生型毒株的生长趋势相当（图 2C）。此外，噬斑试验结果显示，三株重组病毒与野生型毒株的噬斑形态无显著差异（图 2D）。

为进一步证实可逃避抗体压力的关键突变位点，本研究检测了各毒株的中和抗体效价。采用多克隆抗体（pAb）进行的病毒中和试验结果显示，针对第 40 代传代病毒及重组病毒 rA1273P 的中和抗体效价显著下降（图 2E）。此外，间接免疫荧光试验（IFA）与实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）结果表明，与其他毒株相比，重组病毒 rA1273P 表现出显著的血清抗体中和逃逸能力（图 2F~H）。这些发现证实了PEDV S 基因第 1273 位氨基酸丙氨酸（A）→脯氨酸（P）突变的关键意义。

图 2 重组猪流行性腹泻病毒（PEDV）株的构建及特性分析（A）三株重组病毒构建成功。（B）通过间接免疫荧光试验（IFA）鉴定重组病毒。（C）重组病毒的生长曲线。（D）重组病毒的空斑试验结果。（E）多克隆抗体（pAb）对各重组病毒的中和能力。（F）多克隆抗体（pAb）抑制多株重组病毒入侵的间接免疫荧光试验（IFA）结果。（G）使用 Image J 软件对绿色荧光强度进行定量分析。（H）多克隆抗体（pAb）抑制多株重组病毒入侵的实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）结果。

重组病毒的毒力评估

为深入评估重组病毒的毒力，本研究对 5 日龄仔猪开展了攻毒试验。粪便评分结果显示，重组病毒 rA1273P 引起的腹泻严重程度与野生型病毒相当（图 3A）。病毒粪便排泄检测结果表明，重组病毒与野生型病毒的排毒量相当，排泄峰值出现在感染后第 3 天（图 3B）。临床记录显示，重组病毒与野生型病毒均会导致仔猪出现严重腹泻，且伴随肠胀气、肠壁变薄及肠壁透明化等症状（图 3C）。此外，组织学分析结果显示，攻毒组仔猪肠道出现绒毛萎缩与断裂现象，且绒毛高度与隐窝深度比值显著降低（差异具有统计学意义）；重组病毒与野生型病毒引发的上述病理变化无显著差异（图 3D）。肠道绒毛免疫荧光染色结果进一步证实，重组病毒与野生型病毒均能感染肠道绒毛（图 3C）。此外，两组攻毒组仔猪空肠与回肠组织中的病毒载量无显著差异（图 3E）。生存曲线结果显示，重组病毒攻毒组与野生型病毒攻毒组的所有仔猪均在感染后第 7 天死亡（图 3F）。这些发现证实，突变毒株 rA1273P 与野生型毒株的致病性相当。

图 3 重组病毒的毒力评估（A）野生型病毒与突变病毒致仔猪腹泻情况统计。腹泻评分标准：0 分 = 固体粪便；1 分 = 糊状粪便；2 分 = 半液体粪便；3 分 = 液体粪便。（B）口服 PEDV 后，肛拭子中病毒排泄量的每日定量分析。（C）仔猪腹泻状态、解剖图、HE 染色结果及 IFA 检测结果。（D）仔猪肠道绒毛与隐窝比值的统计分析。（E）仔猪回肠和空肠段的病毒载量。（F）仔猪存活率。

重组病毒的体外抗中和抗体逃逸实验

在证实重组病毒与野生型病毒致病性相当后，研究人员进一步开展体外实验，以验证该重组病毒的抗体逃逸能力。为证实该重组病毒对猪体可能存在的免疫逃逸作用，研究人员按图 4A 所示方案，采用 AH2012/12 型PEDV灭活毒株或PBS，对 5 日龄仔猪开展两轮免疫接种。此外，另设 5 头未接种疫苗且未攻毒的仔猪作为对照组。仔猪于免疫接种 24 天后进行攻毒。攻毒前ELISA结果显示，免疫组仔猪血清中的IgG 抗体水平显著高于PBS对照组（图 4B）。通过中和抗体水平检测、间接免疫荧光实验及RT-qPCR开展体外验证，结果证实免疫血清对 rA1273P 突变毒株无保护效力；与之相反，该免疫后血清对 rAH2012 野生型毒株则表现出强效的免疫保护作用（图 4C - F）。

图 4 重组病毒在体外逃逸中和抗体的作用（A）动物实验免疫与攻毒流程示意图。（B）免疫后攻毒前猪体内 IgG 抗体水平检测。（C）免疫后血清对重组病毒及亲本病毒的中和能力。（D）通过 IFA 检测免疫后血清对重组病毒及亲本病毒的吸附抑制能力。（E）使用 Image J 软件对绿色荧光强度进行定量分析。（F）通过 RT-qPCR 分析免疫后血清对重组病毒及亲本病毒的吸附抑制能力。

重组病毒的体内抗中和抗体逃逸实验

为进一步评估该重组病毒逃逸中和抗体的潜在能力，研究人员对攻毒后仔猪的临床症状展开持续监测。腹泻评分结果显示，PBS对照组仔猪的腹泻症状比免疫组更为严重；而在免疫组内部，重组病毒 rA1273P 毒株所致仔猪腹泻的严重程度高于亲本毒株（图 5A）。全程实验中，未接种疫苗且未攻毒的对照组仔猪未出现任何腹泻症状。肛拭子排毒量检测结果表明，PBS对照组的排毒量高于免疫组；免疫组内 rA1273P 毒株的排毒量虽略高于亲本毒株，但仍低于PBS对照组（图 5B）。生存曲线分析显示，免疫后感染 rA1273P 毒株的实验组仅出现 1 例仔猪死亡，与相关组别相比无统计学差异（图 5C）。大体病理学检查、组织切片观察及免疫荧光检测等多项临床表征结果显示，PBS对照组仔猪出现严重腹泻症状，且肠道组织中可见明显的绒毛萎缩、断裂现象，同时检测到病毒感染的阳性信号（图 5D）。在免疫组中，相较于亲本毒株，rA1273P 毒株引发的腹泻症状更严重，造成的肠道绒毛损伤更显著，且病毒载量也更高；而未攻毒的对照组仔猪未出现明显病理变化。此外，免疫组中感染重组病毒的仔猪，其空肠与回肠组织内的病毒载量显著高于感染亲本毒株的仔猪（图 5E）。对组织病理切片的统计学分析同样显示，感染重组病毒的仔猪肠道绒毛与隐窝的比值下降，且绒毛损伤程度进一步加重（图 5F）。此外，研究人员对美国国家生物技术信息中心数据库中逾千株猪流行性腹泻病毒的 S 蛋白进行分析，重点比对其第 1273 位氨基酸位点。结果显示，所有商品化疫苗毒株的该位点均为丙氨酸，而有 7 株临床分离毒株在该位点出现了氨基酸变异（图 5G）。上述研究结果表明，疫苗与治疗性抗体的应用或许会加速PEDV通过变异实现免疫逃逸，不过该病毒发生变异的具体机制仍有待进一步探究。

图 5 重组病毒在体内逃逸中和抗体的作用（A）不同组动物的腹泻评分。腹泻评分标准：0 分 = 固体粪便；1 分 = 糊状粪便；2 分 = 半液体粪便；3 分 = 液体粪便。（B）口服 PEDV 后，肛拭子中病毒排泄量的每日定量分析。（C）不同组动物的存活率。（D）仔猪腹泻状态、解剖图、HE 染色结果及 IFA 检测结果。（E）仔猪回肠和空肠段的病毒载量。（F）仔猪肠道绒毛与隐窝比值的统计分析。（G）疫苗株与临床分离毒株第 1273 位氨基酸的序列比对结果。

PEDV S 蛋白 A1273P 突变不改变蛋白整体结构

PEDV的 S 糖蛋白由 S1 和 S2 两个亚基组成。N 端的 S1 亚基负责介导受体结合，是中和抗体的主要作用靶点。与之不同，S2 亚基参与病毒与细胞的融合过程，包含多个关键结构域：蛋白酶切割位点 S2′、融合肽（FP）、七肽重复区 1（HR1）、七肽重复区 2（HR2）、跨膜结构域（TM）及病毒内尾区（IV）。尽管目前对PEDV S 蛋白的结构已有大量研究，但对其七肽重复区（HR 区）的特征解析仍不够充分。为探究A1273P 突变对融合前 HR1HR2 束整体结构及 S 蛋白三聚体结构的影响，本研究采AlphaFold3 软件进行进一步分析。结果显示，A1273P 突变位于 HR2 区的侧链上，且与六螺旋束区域距离较远（图 6B、C）。该侧链位点的 A1273P 突变未破坏 HR1HR2 蛋白束的整体结构及 S 蛋白的三聚体结构，这与此前针对SARS-CoV-2的相关研究结果一致（图 6B~D）。

基于上述发现，本研究提出如下机制假说：多克隆抗体（pAb）特异性靶向 HR 区，进而抑制 HR 区介导的病毒膜融合过程。关键在于，S 蛋白的 A1273P 突变可能会因脯氨酸的环状侧链引发蛋白构象改变，从而丧失与抗体的结合能力，最终使病毒得以逃逸 pAb 的中和作用。

图 6 S 蛋白 A1273P 突变不改变整体结构（A）猪流行性腹泻病毒（PEDV，登录号 AMZ01557）、人冠状病毒 229E（HCoV-229E，登录号 AAK32191）、人冠状病毒 NL63（HCoV-NL63，登录号 AAS58177）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV，登录号 AHC74098）、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV，登录号 AAP13441）及严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2，登录号 YP_009724390）HR2 区域的序列比对。（B）亲本株和（C）rA1273P 突变株的 HR 区域（HR1：粉色；HR2：绿色；第 1273 位氨基酸：红色）局部及整体结构特征，由 AlphaFold3 预测。（D）S 蛋白的卡通结构图和（E）表面结构图，标注于 PEDV S 蛋白的序列视图中（由 AlphaFold3 预测；S1-NTD：蓝色；S1-CTD：黄色；S2：粉色；HR2：绿色；A1273 位氨基酸：红色）。

讨论

本研究结果表明，在多克隆抗体（pAb）免疫压力下，PEDV S 蛋白会发生一系列点突变。具体而言，S 蛋白第 1273 位氨基酸的丙氨酸（A）→脯氨酸（P）突变，可使病毒逃逸 pAb 的中和作用。此外，动物实验证实，重组毒株 S 蛋白的 A1273P 突变不会影响病毒毒力，但能在体外和体内条件下帮助病毒逃逸抗体压力，最终导致仔猪成功感染并发病。

PEDV S 蛋白在结构上分为 S1 和 S2 结构域，其中 S1 结构域包含四个核心亚结构域，分别为 S1₀、S1A、S1B 和 S1CD。S1B 亚结构域含有主要受体结合域（RBD），该区域位于第 510-640 位氨基酸，可与氨基肽酶 N（APN）结合。S1A 和 S1CD 亚结构域中存在中和表位，已鉴定出 5 个特异性区域，分别位于第499-638、636-789、748-755、746-771 和 1368-1374 位氨基酸。已有研究表明，病毒的体外连续传代可有效降低其毒力。但本研究中，病毒在多克隆抗体（pAb）压力下连续传代 40 代后，口服接种仔猪并未出现致病性下降的现象。这主要是因为本研究使用的是单一突变位点的拯救病毒，而非 PEDV 野毒的直接连续传代；此外，体外传代次数相对有限，且仅对 S 基因进行了测序分析，未对全基因组其他基因展开测序验证。此前有研究在传代毒株中鉴定出与毒力减弱相关的突变位点，例如 S1A 亚结构域的 D265A 突变、受体结合域的 F635R 突变，以及 COE 表位区域的 T502I、T555S 和 G600S 突变。另有研究对 S 基因的测序分析显示，与临床毒株及 CV777 疫苗株相比，该基因存在约 50 个氨基酸突变位点。正如以往观察到的，S 蛋白的突变主要集中在 N 端结构域：其中 COE 表位区域存在 8-12 个可变突变位点，SS6 表位区域仅含 1 个氨基酸突变位点，SS2 表位区域则无突变。研究证实，这些区域的氨基酸替换会降低 PEDV 的结合亲和力、抗原性、致病性及中和活性。而本研究中，病毒经 40 代传代后产生的突变主要位于 S2 区域，这与以往报道的 “毒力减弱相关突变多集中在 S1 区域” 形成差异。这些发现提示，PEDV 的 S1 区域可能在病毒毒力调控中发挥更关键的作用，而 S2 区域的功能仍有待进一步探究。

通常认为，S1 结构域介导病毒的入侵与吸附过程，并能诱导机体产生中和抗体，而 S2 结构域则负责介导病毒与细胞的膜融合。但 Okda 等人通过全病毒免疫小鼠，成功制备出 8 株高活性中和单克隆抗体，其中 7 株可与 S2 亚基发生特异性结合。此外，Feng 等人鉴定出一株特异性中和单克隆抗体，该抗体能有效中和包括 1 型（CV777 株）和 2 型（LNCT2 株）在内的多种 PEDV 毒株，其识别的中和表位核心序列位于第 1261-1337 位氨基酸之间。这些研究结果共同提供了强有力的证据，表明 S2 亚基同样具备诱导中和单克隆抗体产生的能力，这对传统认为 “中和作用以 S1 结构域为核心” 的认知提出了挑战。

本研究在多克隆抗体（pAb）压力下，于 S2 蛋白 C 端附近鉴定出一个新的 A1273P 突变，该突变位点是中和抗体的新关键结合位点。第 1273 位氨基酸位于 S 蛋白的 HR2 区域，AlphaFold3 预测结果显示，A1273P 突变位于 HR2 区的侧链上，且与六螺旋束区域距离较远。结合此前针对SARS-CoV-2的研究，该侧链位点的氨基酸替换未破坏 HR1HR2 的结构完整性及 S 蛋白三聚体的形成。已有研究证实，HR 区是病毒糖蛋白中高度保守的结构，负责介导病毒膜融合。多项研究表明，外源性可溶性 HR2 肽可结合病毒 HR1 区，进而阻断病毒入侵与复制，这一机制在SARS-CoV、MERS-CoV及小鼠肝炎病毒（MHV）中均得到验证。Zhao 等人的研究显示，HR 肽能抑制 PEDV 感染，其中 HR2 肽的抑制效果最为显著；用 HR2 肽免疫小鼠可诱导产生中和抗体，血清经 1:64 稀释后仍能抑制 50% 的 PEDV 感染，这与本研究结果一致。本研究中，S 蛋白的 A1273P 突变使病毒得以逃逸 pAb 的中和作用，其原因可能是脯氨酸的环状侧链导致表位空间结构发生构象改变。与单克隆抗体压力相比，本实验采用的多克隆抗体压力引入了更复杂的影响因素。尽管体外和动物实验均证实该位点突变可介导显著的免疫逃逸，但后续研究应采用不同的单克隆抗体，筛选病毒易发生突变以实现逃逸的关键位点。目前虽已鉴定出 PEDV 的部分中和表位，但对于 S 蛋白中负责逃逸中和抗体的关键氨基酸突变仍不明确。进一步探究 PEDV S 蛋白上的中和表位序列至关重要，这可为研发中和性治疗抗体及高效保护性疫苗奠定理论基础，进而为PED疫苗的开发提供技术支撑。

此外，持续监测并预测PEDV的进化方向，对于快速防控其传播至关重要。PEDV 毒株的进化分析显示，疫苗投入使用后，该病毒的进化速率提升了三倍。对来自不同国家的 672 株代表性 PEDV 毒株的分析表明，PEDV G2 亚群毒株的进化模式存在地域偏好性，韩国毒株进化速度最快，中国毒株则表现出最高的重组率。这些发现提示，PEDV 的广泛接种或免疫压力已加速了病毒的进化。因此，通过体外免疫压力下的病毒进化研究，可预测病毒的进化方向，从而及时制定防控措施，减轻变异病毒引发的感染及经济损失。这不仅为病毒进化预测提供了技术支撑，也为筛选关键中和位点、设计新型疫苗提供了重要思路。

本研究通过人工诱变技术，在抗体压力下对冠状病毒属成员猪流行性腹泻病毒（PEDV）进行突变诱导，成功获得能逃逸亲本毒株诱导产生的中和抗体的突变株，并发现了此前未被报道的新型中和表位。该研究结果为深入理解冠状病毒的免疫逃逸机制提供了新的视角，也为防控冠状病毒感染的干预策略研发带来了新的启发。

注：以上数据仅供参考，不作任何投资建议