西北农林科技大学动物医学院发表在PLOS PATHOGENS题为PoRVA G9P[23] and G5P[7] infections differentially promote PEDV replication by Reprogramming glutamine metabolism的文章。

A群猪轮状病毒（PoRVA）与猪流行性腹泻病毒（PEDV）混合感染在临床中极为常见，导致死亡率升高，但其潜在机制仍不明确。本研究发现，PoRVA 感染在体内外均能促进PEDV感染，且PoRVA G9P【23】 （RVA-HNNY 株）对 PEDV 复制的增强作用显著优于PoRVA G5P【7】 （RVA-SXXA 株）。代谢组学分析显示，与RVA-SXXA 相比，RVA-HNNY能更高效地诱导猪小肠上皮细胞内谷氨酰胺含量升高，进而更显著地促进三磷酸腺苷（ATP）生成以支持PEDV复制，而除去谷氨酰胺则会消除PoRVA感染对PEDV复制的促进作用。进一步研究表明，PoRVA 感染通过上调谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5的表达来促进谷氨酰胺摄取。在SLC1A5敲除细胞中，PoRVA 感染既无法升高细胞内谷氨酰胺水平，也不能促进PEDV复制。PoRVA感染期间，谷氨酰胺分解代谢相关酶（GLS1和GLUD1）的活性和蛋白表达水平也显著升高，通过谷氨酰胺回补反应进入三羧酸（TCA）循环以促进 ATP 生成。GLS1和GLUD1 的小干扰RNA（siRNA）或抑制剂能显著抑制PoRVA对PEDV复制的促进作用。与RVA-SXXA感染相比，RVA-HNNY 感染能更显著地促进SLC1A5、GLS1和GLUD1的表达，从而增强谷氨酰胺的摄取和分解代谢。综上，本研究揭示了PoRVA 感染促进PEDV感染的新机制，并阐明谷氨酰胺摄取调控是PoRVA G9P【23】 和G5P【7】  亚型差异促进 PEDV复制的关键因素。

轮状病毒（RVs）和冠状病毒（CoVs）均为可感染人类及其他哺乳动物的RNA病毒，对公共卫生构成持续威胁。由于其分布广泛且传播效率高，受感染动物往往发病率和死亡率较高。轮状病毒是导致儿童和包括猪在内的养殖动物急性病毒性胃肠炎的重要病原体，为无包膜双链RNA病毒，基因组包含11个片段，编码非结构蛋白（NSP1至NSP5/6）和病毒结构蛋白（VP1至VP4、VP6和VP7）。轮状病毒分为11个不同组（RV A-D、F-L），并根据VP7和VP4的分子特征进一步分为不同的G/P基因型。目前已在猪体内鉴定出A、B、C和H组轮状病毒，其中A群轮状病毒（RVA）被认为是全球范围内猪群中最常见的致病性轮状病毒。猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒科α冠状病毒属，是一种高致病性病原体。该病毒为大型有包膜病毒，基因组为单股正链RNA，全长约28kb，包含至少6个开放阅读框（ORFs）。PEDV已成为全球范围内新兴和再发的猪肠道病毒，给养猪业造成巨大经济损失，尤其对仔猪具有高致死率。PEDV 感染的临床症状包括呕吐、腹泻和脱水，1-3日龄仔猪的死亡率可高达 100%。

在自然条件下，猪会感染多种病毒，且多病毒共感染对疾病结局的影响大于单一病毒感染。共感染的病毒之间以及病毒与宿主共生体之间可发生相互作用，以利用宿主资源或调控宿主免疫反应。病毒感染引起的猪胃肠道疾病长期以来一直是养猪业中最严重的疾病之一，且近年来愈发严重。特别是多种胃肠道病毒共感染不仅会加重肠道疾病的临床症状，还会增加疾病的诊断和防控难度。迄今为止，PoRVA、PEDV及其他常见猪肠道病毒已给中国养猪业造成了相当大的经济损失，且这些猪肠道病毒的共感染在我国多个省份均有报道。

在病毒感染过程中，多种不同的病毒已进化出调控细胞代谢途径的机制，以获取足够的生物分子和能量用于自身存活和复制。由于病毒是专性细胞内寄生物，病毒感染的每个步骤都在“病毒工厂”中进行，而“病毒工厂”是由病毒诱导的代谢重编程细胞形成的。病毒感染会触发宿主细胞的代谢重编程，以满足其生物合成需求，从而实现最佳病毒产量。不同类型的病毒会利用多种策略劫持细胞营养资源，进而决定病毒的致病机制和宿主反应。例如，SARS-CoV-2 感染者可能出现血糖和脂肪酸浓度升高以及氨基酸代谢异常。在 SARS-CoV-2 感染的细胞中，病毒非结构蛋白14（NSP14）会促进TCA循环中多个关键酶的琥珀酰化，这些酶与SIRT5相互作用，从而抑制细胞代谢途径。鼻病毒感染会快速增强葡萄糖利用和摄取相关酶的表达，导致细胞处于高度合成代谢状态。近期研究表明，巨型病毒基因组包含众多参与能量产生的代谢基因。巨型病毒编码的代谢基因还可通过扩展宿主细胞的催化能力来调控宿主代谢，从而有利于病毒复制。尽管病毒触发的代谢改变无疑是研究热点，但病毒诱导代谢重编程的分子机制仍大多未知。

猪肠道疾病的暴发常由多种肠道病毒引起，肠道内多种病毒的共存会加重临床症状，并增加疾病防控的难度。本研究探讨了PoRVA感染通过调控小肠上皮细胞谷氨酰胺代谢促进PEDV复制的机制，并鉴定了PoRVA诱导谷氨酰胺代谢重编程过程中负责谷氨酰胺摄取和转化的主要宿主蛋白。此外，我们还研究了 PoRVA G9P [23]和G5P [7]亚型在谷氨酰胺代谢重编程和促进PEDV复制方面的差异。本研究将有助于深入理解PoRVA感染诱导代谢重编程以促进PEDV复制的机制，以及PoRVA不同亚型在促进PEDV复制能力上存在差异的原因。

PoRVA 感染促进猪体内 PEDV 感染

猪胃肠道疾病通常由多种肠道病毒引起，肠道病毒共感染可能会加剧疾病结局，严重威胁猪群健康。首先，我们对中国中西部地区的肠道病毒进行了流行病学调查。2020年10月至2022年12月期间，从4个省份的34个猪场收集了582 份样本，检测常见病毒的阳性率。结果发现，PoRVA（54.81%，319/582）和 PEDV（42.44%，247/582）是导致受调查猪腹泻的最常见病毒。对肠道病毒感染模式的分析显示，多病毒共感染导致腹泻的比例显著高于单一病毒感染（图1A）。在多病毒阳性病例中，双病毒共感染的比例最高（56.71%，207/365）（图1B），而在双病毒阳性猪中，PEDV与PoRVA 共感染最为常见（32.85%，68/207）（图1B和1C）。此外，在 PoRVA 阳性病例中，与PEDV共感染是最常见的感染模式（210/319），且临床中PEDV感染与PoRVA 感染可能存在关联。

 在多病毒阳性病例中，PoRVA与PEDV共感染导致受感染猪的死亡率更高（图1C）。因此，我们推测PoRVA感染会增强PEDV的感染性和致病性。通过仔猪感染实验，比较了模拟感染、PoRVA 感染和猪科布病毒（PKV）感染对PEDV 感染致病性的影响。结果显示，当接种相同剂量的PEDV时，PoRVA感染显著加重了仔猪的临床症状并提高了死亡率，而PKV感染对仔猪体内PEDV的感染性和致病性无显著影响（图1D-1F）。这些结果表明，PoRVA与PEDV共感染是田间临床中最常见的感染模式，且PoRVA 感染会加剧仔猪的 PEDV 感染。

图 1 在同时感染A群猪轮状病毒 （PoRVA）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）的病例中，PoRVA 会增强PEDV的致病性。（A）病毒阳性病例中肠道病毒的感染模式。（B）病毒共感染模式以及相应病例的数量韦恩图。（C）不同感染模式病例的比较生存分析。PoRVA：A群猪轮状病毒；PEDV：猪流行性腹泻病毒；PKV：猪科布病毒；PBoV：猪博瓦病毒；TGEV：传染性胃肠炎病毒；PDCoV：猪德尔塔冠状病毒；PSV：猪萨佩洛病毒。（D-F）PoRVA 加剧了PEDV在仔猪中的致病性。对这些仔猪分别进行了PoRVA（4毫升，105 PFU/毫升）、PKV（4毫升，105 PFU/毫升）或假病毒（4毫升，DMEM）的感染处理，持续12小时，然后接种4毫升的PEDV（105 PFU/毫升）。每组仔猪的生存曲线（D）、临床意义评分（E）和粪便评分（F）在实验结束时（7日龄）持续监测并记录。ns，无显著差异；*P < 0.05，**P < 0.01（与 PEDV 感染组相比）。

PoRVA G9P [23]基因型比G5P [7]基因型更能促进PEDV复制，增强PEDV致病性

为进一步研究PoRVA感染是否影响PEDV的致病性，我们首先分析了收集样本中PoRVA的基因型。结果显示，VP7基因型G9和G5以及VP4 基因型P [23] 和P [7]是临床PoRVA 感染仔猪中的优势基因型（图2A）。对两株分离的代表性毒株（RVA-SXXA株和RVA-HNNY 株）基于VP7和VP4核苷酸序列的系统发育分析表明，RVA-SXXA株和RVA-HNNY 株的基因型分别为G5P [7]和G9P [23]。RVA-SXXA 和RVA-HNNY在IPEC-J2 细胞中表现出相似的感染性和复制效率，表明PoRVA G5P [7]（RVA-SXXA）和G9P [23]（RVA-HNNY）在体外特性上无显著差异。此外，在动物感染实验中，RVA-HNNY 感染仔猪和 RVA-SXXA 感染仔猪的存活率、临床评分、粪便评分和平均增重均相似。即使在PEDV攻毒后，RVA-HNNY感染仔猪和RVA-SXXA感染仔猪的 PoRVA 排毒量、组织病毒载量和肠黏膜组织病理损伤程度也无显著差异。然而，与单独接种PEDV的仔猪相比，接种相同剂量PEDV时，RVA-HNNY感染仔猪和RVA-SXXA 感染仔猪均表现出更低的存活率，以及更严重的临床症状（如临床评分、粪便评分和平均增重所示）。更重要的是，与RVA-SXXA感染仔猪相比，接种相同剂量 PEDV 时，RVA-HNNY感染仔猪的存活率更低，临床症状更严重。这些数据表明，PoRVA 感染会增强PEDV的致病性，且 PoRVA G9P [23]（RVA-HNNY 株）比G5P [7]（RVA-SXXA株）更能显著增强PEDV的致病性。

为进一步确定不同基因型PoRVA感染对PEDV感染和致病性的影响，我们检测并比较了各组仔猪的病毒排毒量、病毒载量和肠道损伤情况。与 RVA-SXXA/PEDV组仔猪相比，RVA-HNNY/PEDV组仔猪表现出更多PEDV排毒量、十二指肠、空肠、盲肠和直肠组织中更高的病毒载量，以及更严重的肠道损伤（图2B-2E）。与单独PEDV攻击的仔猪相比，RVA-HNNY/PEDV组和 RVA-SXXA/PEDV组仔猪均表现出更多的PEDV排毒量和更高的组织病毒载量（图2B-2E）。为确定不同基因型PoRVA 感染对细胞中PEDV复制的影响，IPEC-J2细胞经模拟感染或RVA-SXXA、RVA-HNNY 感染（MOI=1）12小时后，再感染PEDV（MOI=1），并在PEDV感染12小时后检测PEDV复制水平。与体内观察结果一致，RVA-HNNY 和 RVA-SXXA 感染均能显著促进IPEC-J2细胞中PEDV的复制，且RVA-HNN 的促进作用显著优于RVA-SXXA（图 2F-2I）。然而，当后续感染 PEDV时，RVA-HNNY和RVA-SXXA 在IPEC-J2细胞中的复制水平无显著差异。这些数据共同表明，PoRVA 感染通过促进 PEDV 复制来增强 PEDV 的感染性和致病性，且PoRVA G9P [23]（RVA-HNNY 株）比G5P [7]（RVA-SXXA株）更能显著促进PEDV复制，从而增强PEDV的致病性。

图2 （A）在所有样本中，G型（VP7基因型）和P型（VP4基因型）的占比情况。（B）猪感染PEDV后7天内，通过定量逆转录-实时聚合酶链反应测定的猪流行性腹泻病毒（PEDV）在粪便拭子中的病毒拷贝数。（C-E）在猪感染PEDV 2 天后收集肠道组织。通过逆转录-实时聚合酶链反应定量测定不同肠道段的PEDV病毒载量（C）。通过空斑测定法检测猪仔小肠中的PEDV病毒滴度（D）。计算不同组小肠中VH/CD比值以评估猪仔的肠道病变情况（E）。（F-I）IPEC-J2细胞进行假感染或感染RVA-SXXA或RVA-HNNY（感染比例为 1）12小时，然后在猪感染PEDV（感染比例为1）12小时后通过流式细胞术测定PEDV 阳性细胞的数量（F）。FACS结果的定量显示在该图中。PEDV阳性细胞的百分比以平均值±标准差（n - 3）表示。（G）通过免疫荧光法检测了IPEC-J2细胞中的PEDV和PoRVA 感染情况。图右侧的白色方框为放大图。PEDV N（红色）、PoRVA VP6（绿色）、DAPI（蓝色）。比例尺为 100 微米（H）。通过噬斑测定法检测了PEDV的病毒滴度并进行了定量（I）。*P < 0.05，** P < 0.01，ns 表示无显著差异。

PoRVA和PEDV感染在细胞代谢重编程中的异同

为进一步研究PoRVA感染如何促进IPEC-J2细胞中PEDV的复制，我们检测并比较了RVA-SXXA和RVA-HNNY在病毒感染周期不同阶段对PEDV复制的影响。在病毒感染早期（包括吸附和进入阶段），PoRVA对PEDV的丰度无影响，但在PEDV复制阶段，PoRVA显著增加了病毒丰度，且RVA-HNNY的作用强于RVA-SXXA。由于已有报道称多种轮状病毒株可通过抑制I型干扰素诱导来调控多种病毒感染，我们构建了IFNAR1敲除的IPEC-J2细胞，以探讨PoRVA感染是否通过抑制IFN信号通路促进PEDV复制。然而，在IFNAR1缺陷型（IFNAR1⁻/⁻）IPEC-J2 细胞中，PoRVA 感染仍能促进PEDV复制，且在 IFNAR1⁻/⁻细胞和野生型（WT）细胞中，RVA-HNNY株对PEDV复制的促进作用均强于RVA-SXXA株（图3A和3B）。在IFNAR1⁻/⁻和WT IPEC-J2 细胞中，PoRVA 共感染相关的PEDV 复制增强水平相似。此外，在IFNAR1⁻/⁻和WT IPEC-J2细胞中，RVA-HNNY株均比RVA-SXXA 株更能显著提高 PEDV 水平（图3C）。

病毒已进化出多种调控宿主代谢的机制，为验证 PoRVA 是否通过重塑宿主关键代谢途径来促进PEDV复制，我们进行了代谢谱分析，以评估RVA-SXXA感染、RVA-HNNY感染和PEDV感染的IPEC-J2 细胞中代谢物的变化（图3D）。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结果显示，超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF-MS）数据具有良好的稳定性和可靠性。PoRVA 感染后，代谢物丰度发生显著改变，差异丰度代谢物以火山图形式呈现（图3E）。与未感染的IPEC-J2 细胞相比，RVA-SXXA 感染的IPEC-J2细胞中有 11 种代谢物显著上调，11种代谢物显著下调；而RVA-HNNY感染的IPEC-J2细胞中有32种代谢物显著上调，11 种代谢物显著下调。在 RVA-SXXA和RVA-HNNY感染的 IPEC-J2细胞中均上调的代谢物包括谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、4'- 羟基苯乙酮和十二烷二酸。这些代谢物在RVA-HNNY感染的IPEC-J2 细胞中的丰度高于RVA-SXXA 感染的细胞（图3F ）。

RVA-SXXA和RVA-HNNY感染的IPEC-J2 细胞中下调的代谢物类型存在差异。RVA-SXXA 感染的 IPEC-J2 细胞中下调的代谢物包括5 - 酮二十碳三烯酸、二十碳二烯酸、甘油酸、哌啶酸和肌醇；而 RVA-HNNY 感染的 IPEC-J2 细胞中下调的代谢物包括癸二酸、7 - 脱氢胆固醇、α-生育三烯酚、亚氨基精氨酸和3 -甲基- L -酪氨酸。尽管RVA-SXXA 感染和 RVA-HNNY感染的IPEC-J2 细胞中差异表达代谢物的类型不完全相同，但这些差异表达代谢物主要为氨基酸、脂质及其衍生物（图 3F），这表明 PoRVA 感染期间细胞代谢紊乱主要集中在氨基酸代谢和脂质代谢。这一发现与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析结果一致，PoRVA 感染期间改变的代谢通路主要包括中心碳代谢、氨基酸生物合成、脂肪酸生物合成、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢和精氨酸生物合成。上述结果表明，PoRVA 感染会影响脂质和氨基酸代谢，且RVA-SXXA感染和RVA-HNNY感染的IPEC-J2 细胞中差异表达代谢物的类型和丰度存在差异。

接下来，我们研究了PoRVA 感染和PEDV感染诱导的细胞代谢变化的异同。我们发现，PEDV 感染在IPEC-J2细胞中诱导了更显著的代谢重编程（图 3F），包括63种显著上调的代谢物和8种显著下调的代谢物（图 S5B）。对PEDV诱导的差异表达代谢物进行分类发现，与PoRVA感染类似，PEDV感染也诱导了氨基酸、脂质及其衍生物的差异表达（图3F）。在 PEDV 感染和PoRVA感染的 IPEC-J2 细胞中均上调的代谢物包括谷氨酰胺、精氨酸、天冬酰胺、十二烷二酸、（2R）-2 - 羟基- 3-（磷酸氧基）丙酸酯和4'-羟基苯乙酮。PoRVA 感染和 PEDV 感染的 IPEC-J2 细胞中下调的代谢物类型存在显著差异。PEDV 感染的 IPEC-J2细胞中下调的代谢物包括芥酸、亚氨基精氨酸、十五烷酸、12 -酮-白三烯B4、米氮平、磷酸乙醇胺、尿嘧啶和α-菠菜甾醇。总体而言，PEDV感染期间改变的代谢通路主要包括氨基酸生物合成、嘧啶代谢、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢和辅因子生物合成。这些结果表明，与PoRVA感染相比，PEDV感染诱导的细胞代谢重编程更为显著，且PEDV和PoRVA感染均主要影响肠上皮细胞的氨基酸代谢和脂质代谢。

图3 病毒感染导致IPEC-J2细胞内代谢物发生显著变化。（A-C）野生型和IFNAR1⁻/⁻型IPEC-J2细胞分别以1的感染比例感染RVA-HNNY或RVA-SXXA病毒12小时，然后以 MOI =1的比例感染PEDV病毒12小时。将IPEC-J2细胞裂解并进行蛋白质印迹检测，以检测PEDV N蛋白的表达水平（A）。将 PEDV N蛋白的比例标准化为β-肌动蛋白的比例（B）。收集细胞裂解液样本，通过RT-qPCR对PEDV N基因进行定量，以检测PEDV的复制情况（C）。*P < 0.05，** P < 0.01。（D）用于全局代谢分析的实验设计示意图。在模拟组、RVA-SXXA组、RVA-HNNY组以及PEDV 组中，IPEC-J2 细胞首先在DMEM培养基中培养12小时，然后分别用DMEM培养基（模拟组）、RVA-SXXA（MOI=1）、RVA-HNNY（MOI=1）或 PEDV（MOI=1）进行再培养12小时。每个组包含四个生物学重复样本。提取代谢物并测量其水平。（E）火山图突出显示与模拟组相比，RAV-SXXA 组、RAV-HNNY组和PEDV 组中增加（红色）或减少（蓝色）的代谢物。（F）差异丰度代谢物的热图。每列代表一个样本，每行代表一个差异丰度代谢物。颜色键表示不同代谢物的水平：红色，上调；蓝色，下调。

PoRVA G9P [23]株和G5P [7]株感染对PEDV诱导的细胞代谢重编程具有差异影响

为全面了解PoRVA 感染对PEDV感染诱导的代谢重编程的影响，以及两种轮状病毒亚型（RVA-HNNY和RVA-SXXA）对PEDV感染细胞代谢重编程的差异，我们接下来重点比较PEDV感染、RVA-SXXA/PEDV共感染和 RVA-HNNY/PEDV共感染细胞中代谢物的变化（图4A）。我们发现，与 RVA-SXXA株相比，RVA-HNNY株对IPEC-J2细胞中PEDV感染诱导的代谢重编程的影响更为显著（图4B和4C）。与单独PEDV感染细胞相比，先感染 RVA-HNNY 再感染PEDV的细胞中有24种代谢物显著上调，18种代谢物显著下调（图4C）。丰度改变的代谢物主要包括氨基酸、核苷酸及其衍生物。上调的代谢物包括谷氨酰胺、精氨酸、色氨酸、亚氨基精氨酸、尿苷、胞苷一磷酸（CMP）和鸟苷一磷酸（GMP）。下调的代谢物包括尿苷一磷酸（UMP）、胞苷、焦磷酸和鸟苷等（图4D）。与单独 PEDV 感染细胞相比，先感染 RVA-SXXA 再感染 PEDV 的细胞中有12种代谢物显著上调，12种代谢物显著下调（图4C）。丰度改变的代谢物主要包括核苷酸及其衍生物。上调的代谢物包括腺苷一磷酸（AMP）、尿苷二磷酸（UDP）、花生酸、3 - 磷酸甘油酸和腺苷等。下调的代谢物包括十二烷二酸和鸟苷等（图4D）。

由于病毒依赖宿主细胞获取复制所需的大分子和能量，它们已进化出多种策略来调控细胞代谢和生物合成机制。我们获取了PEDV感染细胞或先感染 PoRVA 再感染PEDV细胞中优势代谢通路相关差异表达代谢物丰度变化的详细信息。我们发现，PEDV感染促进了脂肪酸生物合成，表现为不饱和脂肪酸（包括亚油酸、蓖麻油酸和肾上腺酸）的积累（图5）。PEDV 感染诱导脂质生物合成水平升高，这有利于有包膜病毒复制复合体的形成和病毒传播。令人惊讶的是，尽管我们上述数据表明 PoRVA 感染也会诱导脂质代谢重编程（图3F），但与单独 PEDV感染相比，PoRVA 感染在后续PEDV感染期间对脂质代谢物丰度无显著影响（图4E和5）。RVA-SXXA株或 RVA-HNNY株感染对后续 PEDV 感染诱导的细胞代谢重编程的影响主要集中在氨基酸代谢和核苷酸代谢（图4D和5）。特别是，在后续感染 PEDV 的细胞中，RVA-HNNY比RVA-SXXA 更能有效提高谷氨酰胺、精氨酸和色氨酸水平（图5）。PEDV感染12小时后病毒复制活跃，我们推测此时PoRVA 诱导的代谢物丰度变化可能在促进 PEDV 复制中发挥重要作用。RVA-HNNY和RVA-SXXA对PEDV感染诱导的氨基酸代谢的差异影响是否会影响 PEDV复制仍需进一步验证。

图4 PoRVA G9P[23]株和PoRVA G5P[7]株的感染分别对猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的细胞代谢产生不同影响重新编程。（A）实验设计的示意图。PEDV组中的IPEC-J2细胞首先在DMEM 培养基中培养12小时，然后用PEDV（MOI=1）再培养12小时。RVA-SXXA /PEDV组和RVA-HNNY/PEDV组中的IPEC-J2 细胞首先用RVA-SXXA（MOI=1）或 RVA-HNNY（MOI=1）感染12小时，然后用PEDV（MOI=1）再感染12小时。每个组包含四个生物学重复样本。提取代谢物测量水平。(B)火山图展示了在RAV-SXXA/PEDV、RAV-HNNY/PEDV和PEDV组中增加（红色）或减少（蓝色）的代谢物。(C)不同组中差异丰度代谢物的数量。(D)差异丰度代谢物的热图。每列代表一个样本，每行代表一个差异丰度代谢物。颜色键表示不同代谢物的水平：红色，上调；蓝色，下调。(E)RVA-SXXA/PEDV和RVA-HNNY/PEDV感染细胞与PEDV感染细胞相比的代谢途径富集分析的气泡图。气泡图中的每个气泡代表一个代谢途径。气泡越大，包含的代谢物越多。x轴表示拓扑分析中的途径影响值，其大小与影响因子正相关。y轴表示富集分析中识别的代谢途径。

图5 无靶向代谢组学中代谢物及代谢途径的显著变化示意图。在PEDV、RVA-SXXA/PEDV和RVA-HNNY/PEDV这三个组中，许多代谢物及其相关代谢途径都发生了显著变化。每个组有4个样本。VIP值大于1且p值小于0.05被用作显著差异丰度代谢物的筛选标准。红色表示上调，绿色表示下调。

PoRVA G9P [23]比G5P [7]更能显著促进PEDV复制与谷氨酰胺利用相关

氨基酸是蛋白质合成的底物，但它们也能生成葡萄糖、ATP和脂肪酸，并作为多种生物分子（包括核苷酸碱基和信号分子）的代谢前体。为进一步分析 PoRVA诱导的哪些氨基酸变化会影响PEDV复制，我们检测了各组细胞内谷氨酰胺、精氨酸和色氨酸的水平。我们发现，与对照感染相比，PoRVA（RVA-SXXA 和RVA-HNNY）感染显著上调了谷氨酰胺和精氨酸的水平。在后续感染PEDV的细胞中，RVA-HNNY感染比RVA-SXXA感染诱导的谷氨酰胺和精氨酸水平升高更为显著（图6A）。因此，我们接下来验证了RVA-HNNY比RVA-SXXA更能显著促进PEDV复制是否与谷氨酰胺和精氨酸相关。为排除实验中的其他因素，我们首先确定了维持病毒感染早期细胞活力所需的葡萄糖（2.0 mM）和谷氨酰胺（0.25 mM）的最低必需浓度（图6B和6C）。当IPEC-J2细胞在含有最低必需浓度葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中培养时，RVA-HNNY和RVA-SXXA 均未显著促进PEDV复制（图6D和6E）。在葡萄糖和谷氨酰胺为最低必需浓度的条件下，补充谷氨酰胺可使PoRVA 显著促进IPEC-J2细胞中PEDV的复制，且 RVA-HNNY的作用比RVA-SXXA更为显著（图6D和6E）。相反，外源性补充精氨酸以剂量依赖的方式抑制了PEDV复制（图6F和6G）。值得注意的是，在指定浓度下，谷氨酰胺或精氨酸处理未导致细胞毒性（图6H-6K）。这些结果表明，谷氨酰胺在RVA-HNNY和RVA-SXXA 差异促进PEDV复制中发挥关键作用。

图6 PoRVA 能促进 PEDV 的复制，其机制在于增强谷氨酰胺的摄取。（A）对模拟组和感染组细胞中的谷氨酰胺、精氨酸和色氨酸含量进行定量检测。在模拟组中，IPEC-J2 细胞先在DMEM培养基中培养12小时，然后分别DMEM、RVA-SXXA、RVA-HNNY或 PEDV进行感染，再培养12小时。在RVA-SXXA/PEDV组和RVA-HNNY/PEDV组中，细胞先用 RVA-SXXA或 RVA-HNNY感染12 小时，然后用 PEDV进行感染。色氨酸的含量按照制造商的协议进行检测。（B、C）各组细胞的活力。在每组细胞培养基中添加不同浓度的外源性（B）葡萄糖（0.00、1.00、2.00、4.00 或5.55 mM）或（C）谷氨酰胺（0.00、0.10、0.25、0.50 或2.50 mM）。使用超级增强细胞计数试剂盒 8 进行细胞活力检测。（D-G）谷氨酰胺对于PoRVA 促进PEDV复制的能力至关重要。IPEC-J2细胞先模拟感染或用PoRVA（RAV-SXXA 或 RAV-HNNY）感染12小时，然后用 PEDV感染12小时。感染后的细胞在含有低葡萄糖（2.0 mM）和谷氨酰胺（0.25 mM）的DMEM培养基中在37℃下培养。在添加了相应浓度的外源性谷氨酰胺（1.0、2.0或4.0 mM）或外源性精氨酸（10 mM、20 mM或30 mM）的情况下，测定PEDV 培养基中添加外源性谷氨酰胺（D）或精氨酸（F）的培养物的滴度。通过平板形成实验确定了添加外源性谷氨酰胺（E）或精氨酸（G）的培养基中 PEDV 蛋白的水平。（H-K）谷氨酰胺和精氨酸对细胞活力和细胞数量的影响。将 IPEC-J2 细胞置于谷氨酰胺（0、1、2 或4mM）或精氨酸（0、10、20 或30mM）存在条件下培养 6、12 或 18 小时。在培养18 小时后，通过CCK-8测定法测量了相应剂量的谷氨酰胺（H）和精氨酸（I）的细胞毒性。使用Guava Muse细胞分析仪检测细胞生长（J.K）。误差条表示标准误（n=3）。ns 表示无显著差异；*P < 0.05，**P < 0.01；σσP < 0.01（与PEDV组对照处理相比）；#P < 0.05，##P < 0.01（与RVA-SXXA/PEDV组对照处理相比）；θP < 0.05，θθP < 0.01（与RVA-HNNY/PEDV组对照处理相比）。

PoRVA G9P [23]感染比G5P [7]感染诱导更高水平的SLC1A5 表达，以增强谷氨酰胺摄取

谷氨酰胺是肠上皮细胞的首选能量底物，通过质膜谷氨酰胺转运蛋白（如 SLC1A5、SLC38A1/2和 SLC7A5）转运到细胞内，随后用于己糖胺、非必需氨基酸（NEAAs）和核苷酸的生物合成（图7A）。为探讨 PoRVA 感染促进谷氨酰胺增加的机制，我们检测了PoRVA 感染的IPEC-J2 细胞中谷氨酰胺转运蛋白的 mRNA 水平，以筛选参与RVA-HNNY或RVA-SXXA感染期间谷氨酰胺摄取的转运蛋白。PoRVA 感染上调了SLC1A5和 SLC38A1 的mRNA水平，但对其他谷氨酰胺转运蛋白的mRNA 水平无影响（图7B）。我们在PoRVA 感染（RVA-HNNY和RVA-SXXA）后6、12和18小时收集细胞，以进一步研究 SLC1A5在PoRVA 感染期间的表达情况。结果显示，PoRVA 感染细胞中 SLC1A5表达呈时间依赖性上调，且在 mRNA和蛋白水平上，RVA-HNNY 诱导的 SLC1A5 上调比RVA-SXXA 更为显著（图7C）。免疫荧光实验结果也证实，定位于细胞膜上的SLC1A5 在RVA-HNNY 感染细胞中的表达高于RVA-SXXA 感染细胞（图7D和7E）。

为研究PoRVA 感染期间SLC1A5 对谷氨酰胺摄取的影响，我们构建了 SLC1A5敲除的IPEC-J2细胞用于PoRVA 感染（7F）。在 SLC1A5⁻/⁻IPEC-J2 细胞中，PoRVA 感染未增加细胞内谷氨酰胺浓度（图7G）。在 SLC1A5⁻/⁻IPEC-J2 细胞中，无论是 RVA-HNNY 感染还是 RVA-SXXA 感染，均未有效提高 PEDV 滴度或病毒产量（图7H-7J）。综上，这些结果表明，与G5P [7] 感染相比，PoRVA G9P [23] 感染导致SLC1A5表达上调更为显著，这对谷氨酰胺摄取和PEDV感染促进至关重要。

图7 PoRVA 感染会通过上调 SLC1A5 的表达来增强谷氨酰胺的摄取。（A）谷氨酰胺利用的示意图。（B）IPEC-J2 细胞被未感染或感染了 PORVA（RAV-SXXA 或 RAV-HNNY）处理6小时。通过 RT-qPCR 确定 PORVA 感染对谷氨酰胺转运蛋白 mRNA 表达的影响。（C）检测 PORVA 感染后不同时间点 SLC1A5 的蛋白水平（通过蛋白质印迹法）。（D）通过共聚焦显微镜检测 SLC1A5 的表达和定位。

IPEC-J2 细胞经过固定并用抗 SLC1A5 抗体（绿色）和 DAPI（蓝色）染色。此外，还使用特定探针（红色）检测细胞内的膜蛋白。（E）通过 ImageJ 分析 SLC1A5 蛋白的荧光强度。（F）通过蛋白质印迹法检测 WT 和 SLC1A5-/-IPEC-J2 细胞中 SLC1A5 的表达。（G）检测 PORVA 感染后 WT 和 SLC1A5-/-IPEC-J2 细胞中的谷氨酰胺水平。WT 和 SLC1A5-/-IPEC-J2 细胞分别用 RVA-SXXA 或 RVA-HNNY（感染比例为 1）感染 12 小时。使用谷氨酰胺含量测定试剂盒检测细胞中的谷氨酰胺水平。（H-J）WT 和 SLC1A5-/-IPEC-J2 细胞分别感染 PORVA 12 小时，随后用 PEDV 感染 12 小时。之后，收集细胞裂解物以检测病毒滴度（H）。PEDVN 蛋白质水平（I），以及 PEDV 病毒拷贝数（J）。## 与 RVA-SXXA/PEDV 组对照治疗相比，P < 0.01；与 RVA-HNNY/PEDV 组对照治疗相比，P < 0.01。

PoRVA G9P [23] 感染比G5P [7] 感染更能有效诱导谷氨酰胺回补进入TCA 循环，有利于PEDV复制

谷氨酰胺在细胞代谢中具有多种功能。特别是，它可作为核苷酸、脂肪酸和其他非必需氨基酸的前体，以及氧化磷酸化的底物。为进一步研究PoRVA 感染期间谷氨酰胺代谢通路的变化，我们在PoRVA 感染（RVA-HNNY和RVA-SXXA）12 小时后，检测了谷氨酰胺分解代谢相关多种代谢酶的活性和表达。在这些基因中，谷氨酰胺酶1（GLS1）和谷氨酸脱氢酶 1（GLUD1）的酶活性和蛋白表达上调，而谷草转氨酶（GOT1和 GOT2）、谷丙转氨酶2（GPT2）和谷氨酰胺合成酶（GS）在 PoRVA 感染期间无变化（图8A）。为验证谷氨酰胺分解代谢在PEDV复制中的重要性，我们用 siRNA 沉默了IPEC-J2 细胞中 GLS1 和 GLUD1 的转录水平。在转染后 24 小时验证了siRNA的敲低效率。与对照 siRNA 组相比，siGLS1 组和siGLUD1 组的 GLS1和GLUD1转录水平分别降低了 50% 和 70%（图 S6B）。在 siGLS1 细胞中，PoRVA无法促进 PEDV 感染；与 si-NC 细胞相比，siGLUD1 细胞中 PoRVA对PEDV 复制的促进作用显著减弱（图 S6C-S6E）。然后，我们测试了GLS1和GLUD1 的小分子抑制剂是否会影响 PoRVA 促进PEDV复制的能力。已知GLS 抑制剂 CB-839 可阻断 GLS 的催化中心。GLUD1 抑制剂 R162 直接结合 GLUD1 并抑制其活性，导致细胞内延胡索酸水平降低和活性氧（ROS）水平升高。两种抑制剂均抑制了 PoRVA 促进 PEDV 复制的能力（图8B-8E）。

我们推测，谷氨酰胺回补进入 TCA 循环可提供生物合成前体并维持 ATP 生成，从而促进 PEDV 复制。在RVA-HNNY或RVA-SXXA感染后再感染PEDV 的细胞中，α-酮戊二酸（α-KG）水平显著高于单独 PEDV感染的细胞。且在 RVA-HNNY 感染后再感染PEDV的细胞中，α-KG水平高于RVA-SXXA 感染后再感染PEDV的细胞（图8F）。这些结果表明，PoRVA 感染诱导了谷氨酰胺转化为TCA循环中间产物的回补反应。为进一步研究谷氨酰胺依赖性 TCA 循环在PoRVA促进PEDV复制过程中的作用，IPEC-J2 细胞在含有充足浓度谷氨酰胺（4.0 mM）和最低浓度葡萄糖（2.0 mM）的培养基中培养。二甲双胍可抑制 TCA 循环并升高乳酸生成，在后续实验中用于抑制TCA循环。结果显示，用无毒浓度的二甲双胍（5 mM）处理显著抑制了PoRVA 促进PEDV复制的能力（图8G、8H ），表明TCA 循环参与了PEDV 复制。在低谷氨酰胺培养基（0.25 mM 谷氨酰胺、2.0 mM 葡萄糖）中添加α-KG可部分挽救 PEDV 复制（图8I 和8J），表明谷氨酰胺可转化为α-KG作为TCA循环中间产物，以支持 PEDV 复制。

病毒依赖细胞能量代谢来支持病毒粒子的复制和组装。我们发现，PoRVA 可增加细胞内 ATP 浓度，且 RVA-HNNY 对 ATP 生成的促进作用强于 RVA-SXXA（图 8K）。当细胞先感染 PoRVA 时，PEDV 感染诱导的细胞 ATP 含量增加更为显著（图 8K）。然而，在培养基中缺乏谷氨酰胺的培养条件下，PoRVA 感染无法有效提高细胞 ATP 水平。此外，谷氨酰胺剥夺抑制了 PoRVA 感染对后续 PEDV 感染诱导的细胞 ATP 水平升高的促进作用（图 8K），以及 PoRVA 对 PEDV 复制的促进作用（图 6E）。在 SLC1A5⁻/⁻IPEC-J2 细胞中，PoRVA 感染对后续 PEDV 感染诱导的细胞 ATP 水平升高的影响消失（图 8L）。这些结果表明，PoRVA 通过 SLC1A5 诱导谷氨酰胺分解代谢和谷氨酰胺进入细胞，并增加谷氨酰胺向 TCA 循环的回补通量和 ATP 生成，从而促进 PEDV 复制。此外，与 RVA-SXXA 感染相比，RVA-HNNY 感染更能有效诱导谷氨酰胺回补进入 TCA 循环，这有利于 PEDV 复制（图 9）。

图8 PoRVA G9P[23] 病毒感染相较于 PoRVAG5P[7]病毒感染，能更有效地促使 TCA 循环中谷氨酰胺的无氧分解，这有利于猪流行性腹泻病毒（PEDV）的复制。（A）IPEC-J2 细胞被感染了RVA-SXXA或 RVA-HNNY持续12小时。通过相应的活性检测试剂盒和蛋白质印迹法测定参与谷氨酰胺分解的多种酶的活性和表达。（B - E）IPEC-J2细胞被假感染或感染了RVA-SXXA 或 RVA-HNNY持续12 小时，随后被PEDV感染12小时。在PoRVA 对 IPEC-J2 细胞感染 4 小时后添加溶剂（DMSO）、CB839（10μM）或R162（20μM）。使用平板形成法测定 PEDV 的滴度（B、D）。通过蛋白质印迹法测定PEDV 蛋白质的表达（C、E）。（F）IPEC-J2 细胞在添加低葡萄糖（2.0mM）和谷氨酰胺（4mM）的 DMEM 培养基中培养。IPEC-J2 细胞被假感染或感染了 RVA-SXXA 或 RVA-HNNY持续 12 小时，随后被 PEDV感染12 小时。使用平板形成法测定 PEDV 的滴度。通过α-KG 含量检测试剂盒测定假感染和感染细胞内的α-KG 浓度。（G、H）二甲双胍处理抑制了 PEDV 感染的促进作用。PoRVA 和 IPEC-J2 细胞在含有适量谷氨酰胺（4.0 mM）和最低浓度葡萄糖（2.0 mM）的培养基中进行培养。IPEC-J2 细胞被模拟感染或感染了 RVA-SXXA 或 RVA-HNNY持续 12 小时，随后在含有二甲双胍（5 mM）的环境中感染 PEDV再持续 12 小时。使用噬斑形成试验（G）测定 PEDV 滴度。通过蛋白质印迹法（H）测定 PEDVN 蛋白表达。（I、J）α-KG 在低谷氨酰胺条件下促进 PEDV 的复制。感染了 PEDV 的 IPEC-J2 细胞在含有适量谷氨酰胺的培养基（4 mM谷氨酰胺，2.0 mM葡萄糖）或低谷氨酰胺（0.25mM）的培养基中（添加或不添加7 mM α-KG）进行培养。IPEC-J2 细胞被感染了 PEDV持续 12 小时；使用噬斑形成试验（I）测定 PEDV 滴度。通过蛋白质印迹法（J）测定 PEDVN 蛋白表达。（K）IPEC-J2 细胞被模拟感染或感染了 RVA-SXXA 或 RVA-HNNY持续 12 小时，随后感染 PEDV再持续 12 小时。PoRVA 感染后，IPEC-J2 细胞在完整的培养基或无谷氨酰胺的培养基中继续培养。在PEDV感染12 小时后，使用 ATP 含量测定试剂盒检测细胞内 ATP 水平。（L）WT或 SLC1A5-/- 的 IPEC-J2 细胞被模拟感染或感染了 RVA-SXXA 或 RVA-HNNY持续12小时，随后感染 PEDV再持续 12 小时。h. 在PEDV感染12小时后，使用 ATP 含量检测试剂盒检测了细胞内 ATP 的水平。误差条表示 3 次独立测定的平均值的标准偏差。σP < 0.05（与 PEDV 组与对照治疗组相比）；##P < 0.01（与 RVA-SXXA/PEDV 组与对照治疗组相比）；θθP < 0.01（与 RVA-HNNY/PEDV 组与对照治疗组相比）。

图9 PoRVA G5P[7]和G9P[23]促进PEDV复制的机制示意图。在感染这两种PoRVA亚型病毒时，SLC1A5（一种谷氨酰转运蛋白）的表达水平会上升。与PoRVA G5P[7]（RVA-SXXA 型）相比，PoRVA G9P[23]（RVA-SXXA 型）感染时SLC1A5的表达水平上升得更为显著，这极大地增加了谷氨酰胺的摄取量，并导致细胞内谷氨酰胺水平升高。细胞内的谷氨酰胺会由谷氨酰胺酶1（GLS1）水解为谷氨酸，然后谷氨酸再被脱氢酶1（GLUD1）转化为α-酮戊二酸，进一步进入三羧酸循环以增加 ATP 的生成。值得注意的是，感染PoRVA G9P[23]的细胞中GLS1和GLUD1 的代谢酶活性和表达水平显著上升。因此，PoRVA G9P[23]的感染显著增加了更多的 ATP 合成，以支持PEDV的复制，而PoRVA G5P[7]的感染也是如此。

先前研究已报道在肠道和粪便中可同时检测到多种猪肠道病毒，且多种肠道病毒的共存可能对病毒感染产生协同或拮抗作用。PoRVA和PEDV是两种广泛存在的肠道病毒，可引起猪和野猪的急性病毒性胃肠炎，给养猪业造成重大经济损失。PoRVA 和 PEDV 共感染在自然感染中相当常见，并导致新生仔猪死亡率升高。然而，目前中国PoRVA和PEDV的流行病学现状仍不清楚。本研究分析了2020-2022年期间来自中国中西部4个省份（陕西、甘肃、山西和河南）的582 份腹泻样本，以调查该地区猪群中猪肠道病毒的传播情况。肠道病毒流行病学调查结果显示，导致猪群腹泻的主要病原体为 PoRVA（54.81%，319/582）和 PEDV（42.44%，247/582）。更重要的是，我们发现大量腹泻猪（210/582）同时感染了PoRVA和PEDV，且证实了这两种病毒感染之间存在潜在关联。因此，我们推测，在田间条件下，PoRVA-PEDV共感染的致病潜力显著高于单独PoRVA 或 PEDV感染，因为PoRVA感染会促进继发性PEDV感染。我们在动物实验中验证了 PoRVA 感染会促进PEDV感染的致病性和死亡率这一假设。此外，我们发现 PoRVA 感染通过在体内外增加PEDV复制来促进PEDV感染。然而，与自然感染不一致的是，与PEDV感染仔猪相比，PKV/PEDV感染仔猪的临床症状和死亡率无显著变化。这种差异可能由多种因素导致，如受感染猪的抗病毒免疫力、与其他病原体的共感染、饲养环境和猪的应激反应等，这些因素均可能影响自然感染猪的死亡率。

在所有轮状病毒组中，PoRVA 是导致仔猪急性腹泻的主要原因。PoRVA 株具有抗原异质性，根据外衣壳蛋白VP7和VP4 可分为多种G 型和P型 。与先前研究一致，本研究表明中国中西部猪群中循环着多种基因型组合的 PoRVA，其中 G9P [23]和G5P [7]占主导地位。我们从腹泻样本中分离出 RVA-HNNY 株和 RVA-SXXA 株，分别作为G9P [23]和G5P [7] 基因型的代表性毒株。有趣的是，尽管RVA-HNNY（G9P [23]）和RVA-SXXA（G5P [7]）均能促进 PEDV 复制，但 RVA-HNNY 感染对 PEDV复制的促进作用显著优于 RVA-SXXA 感染。这种现象与这两种轮状病毒亚型在 PEDV 复制阶段增加病毒丰度的能力有关，且不依赖于I 型干扰素信号通路。我们的数据显示，PoRVA 和 PEDV 共感染表现出明显的协同致病效应。在猪病毒共感染模型中，许多报道表明共感染期间病毒复制会受到影响。我们还发现，在这两种病毒共感染的仔猪中，PoRVA 促进了PEDV 复制，且与 PoRVA G5P [7]相比，G9P [23] 更能显著增加 PEDV 复制。在 PoRVA/PEDV 共感染组仔猪和感染不同基因型 PoRVA 的仔猪之间，PoRVA 的基因组复制或编码蛋白表达无显著差异。然而，我们的发现并不意味着在这两种病毒共感染期间PEDV对PoRVA无影响。PEDV 对 PoRVA 病毒感染性的影响仍不清楚，需要在未来进一步研究。

病毒已进化出调控宿主细胞代谢的机制，以满足其最佳复制所需的能量和生物合成需求。我们通过全局代谢组学筛选分析了 PoRVA 感染的 IPEC-J2 细胞的代谢组学特征。PoRVA 感染主要影响氨基酸代谢和脂质代谢，且 RVA-SXXA 感染和 RVA-HNNY 感染细胞中差异表达代谢物的类型和丰度存在差异。与 PoRVA 感染相比，PEDV 感染在 IPEC-J2 细胞中诱导了更显著的代谢重编程（图3）。与 PoRVA 感染类似，PEDV 感染也会调控细胞氨基酸代谢。氨基酸代谢在维持细胞稳态中发挥重要作用。对代谢组学结果的进一步分析显示，在 PoRVA 感染和 PEDV 感染的细胞中，谷氨酰胺水平均升高。

谷氨酰胺作为能量、碳和氮骨架的来源，是肠上皮细胞和免疫细胞的主要呼吸燃料。谷氨酰胺是一种非必需氨基酸（NEAA），但在病毒感染情况下，细胞对谷氨酰胺的需求远远超过其自身合成速率，使谷氨酰胺成为维持正常细胞状态的必需氨基酸。因此，谷氨酰胺也被认为是条件必需氨基酸。谷氨酰胺可为病毒蛋白和核苷酸的合成提供碳源或氮源，这对病毒复制至关重要。近期研究表明，病毒可能会增加谷氨酰胺的摄取和利用以促进自身复制。例如，丙型肝炎病毒（HCV）感染会增加谷氨酰胺的利用和依赖性，抑制谷氨酰胺代谢可减轻 HCV 感染和氧化应激。谷氨酰胺是赤点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）复制所必需的，谷氨酰胺缺乏不影响细胞活力，但会显著抑制 RGNNV 复制。同样，腺病毒通过 MYC 激活重编程谷氨酰胺代谢，以促进最佳子代病毒粒子的生成。我们的数据表明，与 RVA-SXXA 相比，RVA-HNNY 更能显著诱导谷氨酰胺摄取，从而促进 PEDV 复制。我们检测了 PoRVA 感染的肠上皮细胞中谷氨酰胺转运蛋白的表达，确定 PoRVA 感染主要通过上调 SLC1A5/ASCT2 的表达来增加谷氨酰胺摄取。谷氨酰胺转运蛋白是介导谷氨酰胺进出细胞的膜结合蛋白。在这些基因中，SLC38A1/2/5/7、SLC7A5/6/7/8 和 SLC1A5 已被证明在肠上皮细胞中表达。敲低 SLC1A5 不仅抑制了 PoRVA 感染诱导的细胞内谷氨酰胺水平升高，还消除了 PoRVA 感染对 PEDV 复制的影响。这一发现揭示了 SLC1A5 在 PoRVA 感染期间调控谷氨酰胺摄取的重要性。类似地，HCV 感染上调 SLC1A5 以驱动癌细胞的谷氨酰胺成瘾，近期研究表明 SLC1A5 的膜定位会增加能够结合 SARS-CoV-2-RBD 的 hACE2 受体的存在。我们的数据以及近期关于SLC1A5在病毒感染细胞中作用的研究表明，SLC1A5 在病毒生命周期中发挥重要作用。

谷氨酰胺参与增殖细胞中的多种重要代谢过程，在这些过程中，谷氨酰胺被谷氨酰胺酶降解为谷氨酸，谷氨酸进一步代谢为代谢中间产物，参与不同的合成代谢和分解代谢途径。已知肿瘤细胞对谷氨酰胺具有代谢依赖性，并可通过激活谷氨酰胺分解代谢来弥补葡萄糖衍生的 TCA 循环中间产物的损失。多种病毒感染也会诱导谷氨酰胺分解代谢，以增加谷氨酰胺向 TCA 循环的回补通量，并补充感染细胞中的 TCA 循环中间产物，这一过程为病毒最佳复制提供了生物能量和生物合成支持。在此，我们观察到 PoRVA 感染增加了与谷氨酰胺分解代谢相关的 GLS1 和 GLUD1 的酶活性和表达，且 RVA-HNNY 感染的作用比 RVA-SXXA 感染更为显著。然而，负责催化谷氨酸转化为谷氨酰胺的谷氨酰胺合成酶（GS）的活性或表达水平无显著变化。这一发现表明，PoRVA 感染诱导的细胞内谷氨酰胺含量增加是由于谷氨酰胺摄取而非谷氨酸转化。GLS 抑制剂 CB839 和 GLUD1 抑制剂 R162 均抑制了 PoRVA 促进 PEDV 复制的能力，表明谷氨酰胺分解代谢对 PoRVA 感染促进 PEDV 复制至关重要。我们进一步证实，PoRVA 感染诱导谷氨酰胺通过α-KG 进入TCA 循环，这参与了 PEDV 复制（图 8F-8H）。谷氨酰胺缺乏对 PEDV 复制的有害影响可通过 α-KG 部分挽救。我们未观察到α-KG 能完全恢复 PEDV 病毒产量，这可能是由于在 PoRVA 感染期间，谷氨酰胺还需要支持其他代谢途径，如用于病毒复制和子代病毒生成的核苷酸和其他氨基酸的合成。与 RVA-SXXA 感染相比，RVA-HNNY 感染更能显著增加细胞内 ATP 含量，这为继发性 PEDV 感染中的 PEDV 复制提供了更多能量。进一步研究 PoRVA 感染诱导的谷氨酰胺代谢是否通过其他途径促进 PEDV 复制，将有助于阐明病毒诱导的代谢重编程的复杂作用。

总之，我们发现PoRVA和PEDV共感染在我国中西部猪群中极为常见，且具有高死亡率。PoRVA 感染在体内外均能促进PEDV感染，且PoRVA G9P [23]（RVA-HNNY 株）比G5P [7]（RVA-SXXA 株）更能显著增强PEDV复制。我们的结果显示，PoRVA 感染显著改变了猪小肠上皮细胞的谷氨酰胺代谢，且与 RVA-SXXA 相比，RVA-HNNY 诱导细胞内谷氨酰胺含量升高更为显著。细胞内谷氨酰胺水平升高促进了PEDV复制。此外，我们鉴定了促进PEDV复制的谷氨酰胺代谢通路。综上，我们的发现有助于深入理解 PoRVA 感染如何诱导代谢重编程以促进PEDV复制，以及PoRVA不同亚型在促进PEDV复制能力上存在差异的原因。